Summary
En exakt murina modell för akut njurskada (AKI) på grund av ischemi är ett viktigt verktyg för att undersöka akut njurskada och kanske hitta behandlingsmetoder för behandling av njurskador. Den hängande vikten systemet erbjuder ett verktyg för omedelbar och pålitlig njurartärstenos ocklusion och reperfusion utan att orsaka nedsatt trängsel.
Abstract
Hos inlagda patienter, är över 50% av fallen av akut njurskada (AKI) som orsakas av nedsatt ischemi 1-3. En nyligen genomförd studie på inneliggande patienter visade att bara en mild ökning av serumkreatinin nivåer (0,3 till 0,4 mg / dl) är associerad med en 70% större risk för död än hos personer utan någon ökning 1. I linje med detta kirurgiska ingrepp som kräver gränsöverskridande fastspänning av aorta och njurkärl är förknippade med en nedsatt njurfunktion på upp till 30% 4. Likaså sker AKI efter hjärtkirurgi i över 10% av patienterna under normala förhållanden och är förenat med en dramatisk ökning av dödligheten. AKI är också vanliga komplikationer efter levertransplantation. Minst 8-17% av patienterna i slutändan kräver nedsatt substitutionsbehandling 5. Dessutom är försenad transplantatfunktion grund av tubuli cellen skada under njurtransplantation ofta relaterade till ischemi-associerad AKI 6. Dessutom förekommer AKI i cirka 20% av patienter som lider av sepsis 6. Förekomsten av AKI är förknippad med en dramatisk ökning av sjuklighet och dödlighet 1. Terapeutiska metoder är mycket begränsade och de flesta av observationsstudier i Aki har misslyckats i människor. Därför är ytterligare terapeutiska metoder för att förhindra njurskador från ischemi brådskande 3, 7-9.
För att klarlägga mekanismerna för renal skada på grund av ischemi och möjliga terapeutiska strategier musmodeller är intensivt krävs 7-13. Musmodeller ger möjlighet att utnyttja olika genetiska modeller inklusive gen-riktade möss och vävnad specifik gen inriktade möss (CRE-flox system). Dock är murina renal ischemi tekniskt utmanande och experimentella detaljer väsentligt påverka resultaten. Vi genomförde en systematisk utvärdering av en ny modell för isolerade njurartärstenos ocklusion hos möss, som uttryckligen undviker användningen av fastspänning eller suturering renal BLOMSTJÄLK 14. Denna modell kräver en nefrektomi i höger njure sedan ischemi kan bara utföras i en njure på grund av den experimentella inställning. Faktum är att med hjälp av en hängande vikt system är njurartären enda instrumenterade gång under det kirurgiska ingreppet. Dessutom sker ingen venös eller urinledarblockering med denna teknik. Vi kunde visa time-dosberoende och mycket reproducerbara njurskador med ischemi genom att mäta serumkreatinin. Dessutom, när man jämför denna nya modell med konventionell fastspänning av hela BLOMSTJÄLK, nedsatt skydd av ischemisk prekonditionering är djupare och mer tillförlitlig. Därför hans nya tekniken kan vara användbara för andra forskare som arbetar inom området för akut njurskada.
Protocol
Allmänna anmärkningar. All verksamhet bör ske under en upprätt dissekera mikroskop (Leica) och genom att använda en kirurgisk coagulator. Mössen i experimentella grupper ska matchas i ålder och vikt för att garantera jämförbarhet av resultaten. Temperatur, blodtryck, anestesi-och vätsketillförsel ska vara stabil och övervakas under experimentet.
1. Anestesi och kirurgi
- Nedsatt ischemi experiment kan antingen utföras med samtidigt ansöker ischemi och reperfusion att båda njurarna, eller efter enkel nefrektomi i kombination med ischemi behandling av de återstående njuren. Som bilaterala ischemi behandling av båda njurarna är associerad med ökad tekniska svårigheter, en mer komplex experimentell inställning och längre kirurgi, kommer vi att göra en rätt nefrektomi följt av ischemi behandling av de återstående vänstra njuren genom att använda en hängande viktsystem. Vi utnyttjade detta hängande vikt systemet också för koronar ocklusion i hjärtat. Däremot är förfarandet annorlunda eftersom njurartären kan isoleras från den omgivande vävnaden medan kranskärl ligger inom hjärtmuskeln.
- Möss (8-14 veckors ålder, kön) kommer att bedövas med pentobarbital i en dos av 70mg/kg. Vi kommer att upprätthålla anestesi med ca. 10 mg / kg / h natrium pentobarbital. Överdosering kan betydligt lägre blodtryck och därmed kan förändra resultaten. I våra inledande studier har vi också använt ketamin och xylazin. Men framkallade dessa föreningar en stark bradykardi (150 / min). Förutom de observerade bradykardi finns det också belägg för att båda föreningarna är involverade i skyddsmekanismer under villkoren för ischemi. Flyktiga anestetika kan inte användas antingen på grund av deras förmåga att framkalla även nedsatt skydd och lågt blodtryck. Därför är vårt slutgiltiga val för anestesi var pentobarbital. Dessutom är ketamin och xylazin primärt utsöndras via njurarna. Nefrektomi och ischemi kan förlänga ketamin anestesi.
- När smärtan reflexer är frånvarande (testat genom att klämma tårna med pincett) möss kommer att placeras på en temperatur-kontrollerad uppvärmning tabellen (RT, Effenberg, München, Tyskland för att upprätthålla kroppstemperaturen vid 37,0 ° C) i en vänster lateral trycksår position.
- Fäst nedre och övre extremiteterna till bordet med tejp.
- För icke-överlevnad operationer, som visas i videon demonstrationen, täcker snittet området med mineralolja för att förhindra inandning av musen håret genom att skära i huden och på så sätt förebygga risken för allergier mus hår. Vid överlevnad experiment korrekt aseptisk teknik, bland annat klippning av hår, desinfektion av huden med iodophors (t.ex. Betadine), steril hantering av autoklaveras instrument och använda masker ett sterila handskar för kirurgen krävs. Mineralolja används inte i överlevnad operationer. För överlevnad operationer steril NaCl används
- Högra flank snitt kommer att utföras med en sax och en koagulation elektrod (Erbe, ICC50, Tyskland) för att förhindra blödning i muskeln och fartyg hud. I motsats till åtkomst till njurarna via mittlinjen laparotomi, kräver denna teknik inte tillgång till bukhålan.
- Den renala BLOMSTJÄLK inklusive njurartärstenos och nedsatt ven är knyts ihop med en 4 / 0 siden sutur och höger njure kommer att skära ut med en sax utan att störa binjure fartyg.
- Operationssåret är stängt med kontinuerlig sutur (två stygn) av muskeln väggen och hud med en 4 / 0 sutur.
- Djuren placeras sedan i en rätt lateral trycksår position och en vänster flank snitt kommer att utföras.
- Den vänstra njuren är försiktigt bort från bindväv, undvika binjuren och fartyg.
- Därefter är njurarna slås med dess ventrala sida ner i en Lucite kopp. Den Lucite koppen ska steriliseras för att överleva operationer. Stången i njuren är noga trycks in i Lucite koppen genom att hålla den omgivande vävnad med en pincett. Därefter stången är noga trycks in i Lucite koppen med en pincett. Njuren kommer att hållas fuktiga och varma med en våt kompress fuktad med vatten vid 37,0 ° C.
- Efter exponering av vänster njure och placering i en Lucite kopp njuren innehavaren är återhållsam ventralt ha spänning på njurkärl. En tillräcklig besöksförbud är viktigt för en lyckad placering av sutur under njurartären. Därefter njurarna innehavaren är fast och njurartären lätt kan identifieras som den körs på toppen av nedsatt venen.
- Den njurartären dissekeras från angränsande vävnad, i närheten av de take-off från bukaorta med fin pincett. Artären är dissekerade från underliggande ven med en böjd pincett högst upp.
- En 8 / 0 siden suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland) placeras under njurartären genom att användaen pincett som en ledande guide. Denna teknik gör avbrott endast den arteriella blodflödet till njuren utan komprimering av nedsatt ven, jämfört med fastspänning av nedsatt BLOMSTJÄLK.
- Den sutur placeras över en liten stolpe (kan vara ett förberett säkerhetsnål) och en vikt på ca. 1g är fäst vid varje ände (Eppendorf-rör). Vikten kan anpassas till njurarna storlek genom att ta ut eller lägga till vatten till Eppendorf-rör. Bör dock artären vara något dras uppåt, så att inget blod som rinner genom artären, men utan större sträcka på artären. Stora sträcka stress på artären kan skada kärlväggen med förtjockning av kärlväggen och minskat reperfusion.
- Medan de vikter som inte stöds, är den njurartären omedelbart blockerad. Däremot när vikterna stöds, är blodflödet omedelbart återställas till orgeln. Framgångsrik ocklusion bekräftas av en färgförändring från rött till vitt.
- Olika ischemi gånger kan utföras i enlighet med experimentet. En komplett reperfusion kommer att äga rum beroende på längden av ischemi tiden. Ischemi gånger upp till 45 minuter kan återvinnas njurskada. I våra experimentella inställningar vi använde för 20 upp till 30 minuters ischemi med ett medium njurskador som tillåter oss att se förbättringar samt nedskrivning av njurskador beroende på musstam och behandling.
- Efter fullständig reperfusion njuren kan ersättas ur Lucite koppen. Därför njurarna innehavaren är ofixerade och spänningen på njuren släpps. Den kraniala polen är försiktigt bort ur koppen med en intetsägande pincett och den bakre stolpen följer omedelbart.
- Den fixering (band) av musen kan frigöras och musen kan placeras i ryggläge för t.ex. märkt FITC-inulin clearance.
- I delmängder av experiment, kan blodtryck och puls registreras under hela det kirurgiska ingreppet. Blodtryck mätningar erhålls kontinuerligt via en halspulsådern kateter. I korthet är halspulsådern exponeras via dissektion av paratracheal muskler. Efter ytterligare exponering och noggrann undvikande av vävnad trauma (särskilt vagusnerven) är en kateter sätts in i fartyget med hjälp av två suturer och en liten klämma. Blodtrycket mäts med en Statham element (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Schweiz).
- För FITC-märkt inulin clearance en kateter måste placeras i den vänstra halsvenen för infusion av natriumklorid och FITC-märkt inulin. Dessutom en blåsa kateter måste sättas in för urin samling i ett tidsberoende sätt som förklaras nedan i detalj.
2. Mätning av njursvikt
- I allmänhet: Följande resultat parametrar rekommenderas att bestämma njurskada efter renal ischemi:
Utför FITC-märkt inulin clearance att bedöma glomerulär filtrationshastighet (GFR). Som ett alternativ bestämma kreatininclearance och serumkreatinin via metabola bur undersökning 24 timmar efter njurskador. Utför nedsatt H & E färgning och en myeloperoxidas (MPO) ELISA för att fastställa renal skada och inflammation 24 timmar efter renal ischemi. - Metabola bur utredningar:
- Efter ischemi den vänstra njuren slås tillbaka till retroperitoneal position och såret är stängt enligt ovan.
- Vid slutet av operationen möss får 0,3 ml fysiologisk koksaltlösning IP och återhämta sig i 2 timmar under en värme lampa.
- Därefter möss kommer att placeras in i metabola burar (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Tyskland) för bestämning av nedsatt funktionella parametrar för 2 gånger på 24 timmar.
- Vattnet intag av varje mus måste bestämmas genom att väga den tom och fylld flaska med vatten innan leverans till musen och än 24 timmar senare genom att väga hela flaskan igen. Musen vikt måste fastställas också.
- Efter 24 timmar cirka 75μl blod tas från den venösa plexus bakom ögat via ett kapillärrör i korta isoflorane anestesi.
- Njurfunktion bedöms genom att mäta plasma och urin kreatinin 24 timmar efter nedsatt ischemi med ett kommersiellt tillgängligt colorimtric metoden enligt tillverkarens `s protokoll (LT-SYS, Labor + Technik, Berlin, Tyskland). Plasma-och urin av Na +, K + bestäms med låga utsläpp fotometer (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland). Njurar utsöndringsorganen och hemodynamiska värden beräknas med hjälp av vanliga formler 15-17.
- Inulin clearance: FITC-inulin clearance experiment ska utföras efter renal ischemi.
- Den vänstra halspulsåder är kanylerade för kontinuerlig inFusion. Efter att dissekera venen från angränsande vävnad med ett preparat sax (Dumont, WPI) placera två suturer (4 / 0) runt venen. Placera en klämma på venen innan proximale suturen för att stoppa blodflödet. Därefter stänger distala knut och placera en tyngd på en av de distala sutur slutar anstränga spänning på ven. Detta är mycket viktigt att få kateter i venen. Använd en mikro-sax för att klippa en liten öppning in i venen. Håll öppningen med en fin pincett (Dumont, WPI) och placera kateter in i venen. Att föra katetern ta klämman av. Se till att det inte finns någon spänning på katetern så att du kan placera den ner utan att hålla den. Därefter stänger den andra proximala sutur över venen och katetern.
- En kateter placeras i urinblåsan för tidsinställda urinsamlingen. Därför ska du klippa ett kort snitt i huden över blåsan. Ta försiktigt bort urinblåsan genom huden hålet. Fixa blåsan med en våt vävnad. Placera en förberedd sutur över urinblåsan (4 / 0).
- Klipp en kort bit av en kateter (1,5 cm) och värme på slutet för att få en ring runt katetern vilket gör det lättare att fixa det i urinblåsan.
- Skär ett hål i blåsan på sitt allra överst. Gör snitt mellan fartygen för att förhindra blödning. Sätt in den stora änden av katetern i urinblåsan och stäng sutur över katetern och urinblåsan.
- Alla möss får en bolusdos på 0,85% natriumkloridlösning i ett belopp som motsvarar 20% av kroppsvikten. Kontinuerlig infusion hålls på en hastighet av 800ul/h/25g kroppsvikt och FITC-inulin läggs till infusionen för utvärdering av hela njuren glomerulär filtration (GFR). Efter stabilisering av de djur för 20 min, 20 min tidsinställda urin samlingar utförs (fyra gånger) för bestämning av urinflödeshastighet och FITC-inulin. Blod erhålls i mitten av varje period för mätning av FITC-inulin.
- När du startar insamling perioder i 20 minuter använd en timer. Samla urinen genom att placera i slutet av urinblåsan kateter i en liten Eppendorf-rör. Mät röret vikt före och efter urinprovtagningen så att du kan bestämma urin beloppet. Blodprov tas via retroorbital blodtappning bildar venösa plexus via kapillärrör i mitten av varje samling period.
- Blodet och njurarna kan samlas in efter varje förfarande för vidare analys, t.ex. MPO ELISA, cytokin EISA, histologi.
3. Representativa resultat:
Figur 1 Modell av en hängande vikt för renal ischemi:. En hängande vikt system har upprättats för att framkalla renal ischemi i vänster njure. Därför är en 8,0 nylon sutur var placerad under njurartären och i slutet av varje sutur en liten vikt (1 g) var knuten. Denna experimentella designen gör reversibel ocklusion av njurartären genom att tillämpa och släppa vikt lasten.
Discussion
Sammanfattningsvis beskriver den aktuella studien en ny teknik för att utföra renal ischemi i en mus-modell med hjälp av en hängande vikt för njurartärstenos ocklusion. I själva verket visar denna studie mycket reproducerbara skada, vilket skulle minimera variabiliteten i samband med fastspänning av renal BLOMSTJÄLK.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Den nuvarande studierna fick stöd av amerikanska National Institutes of Health bidrag R01-HL092188, R01-DK083385 och R01HL098294 och Stiftelsen för anestesi utbildning och forskning (FAER) Bidrag till HKE, en FAER bidrag till JYD och en DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Forskning Fellowship (GR2121/1-1) till AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | World Precision Instruments, Inc. | a fine microvessel scissor |
References
- Abuelo, J. G. Normotensive ischemic acute renal failure. N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).
- Lameire, N. The pathophysiology of acute renal failure. Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).
- Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping. Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).
- Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation. Hemodial Int. 11, Suppl 3. S7-S12 (2007).
- Schrier, R. W., Wang, W. Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).
- Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia. PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).
- Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).
- Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia. J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).
- Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. Mediators of inflammation in acute kidney injury. Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).
- Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure. Transplantation. 80, 643-649 (2005).
- Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).
- Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors. Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).
- Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).
- Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).
