Summary
Protocol
إعداد كولاجيناز
- تزن خارج كولاجيناز الى 50 مل العازلة العزلة المخروطية وإضافة إلى جعل تركيز النهائي ، كما هو مبين في الجدول أدناه. حل كولاجيناز بواسطة vortexing.
(12 + 2 الفئران الفئران الفئران اضافية = 14 × 5 مل / الماوس = 70 مل حل كولاجيناز الكل)
(70 مل س 0.5 ملغ / مل أو 0.3 ملغ / مل = 35 ملغ أو 21 ملغ من مجموع كولاجيناز ف)سلالة عمر كولاجيناز P (ملغ / مل) الوقت (دقيقة) C3H ، BALB / C ، B6 > 12 أسبوعا 0.8 17 C3H ، BALB / C ، B6 <= 12 أسبوعا 0.5 13 NOD والنرويج وNON > 12 أسبوعا 0.8 17 NOD والنرويج وNON <= 12 أسبوعا 0.5 17 - الاستغناء 2 مل من محلول كولاجيناز في كل قارورة من الزجاج ومكان على الجليد. تحميل كل حقنة 5 مل مع 3 مل من الإبرة كولاجيناز 30G إضافة ومكان في الجليد (في إعداد هود).
نفخ
- قبل التشريح والتضحية الحيوانية خلع عنق الرحم. رش الجسم كله مع 70 ٪ من ETOH ، مما يجعلها رطبة تماما. جعل V - insision ابتداء من المنطقة التناسلية. تدوير الماوس حتى الذيل تواجه بعيدا عنك.
- إزالة الأمعاء إلى الجانب الأيسر من الماوس مفتوحة. وسوف يعرض هذا البنكرياس والقناة الصفراوية المشتركة.
- وضع المشبك مرقئ على جانبي الأمعاء الصغيرة ، حيث تستنزف القناة الصفراوية ، وترك الحل للجيب صغير للدخول كولاجيناز الأمعاء.
- تضخيم البنكرياس من خلال القناة الصفراوية باستخدام إبرة حقنة 30G و 5 مل تحتوي على 3 مل من محلول كولاجيناز الباردة ، بدءا من المرارة.
- إزالة البنكرياس من الجسم ووضعه في قارورة تحتوي على siliconized 2 مل من محلول كولاجيناز. وينبغي القيام بهذه الخطوة بسرعة وبطريقة نظيفة قدر الإمكان ، والتقليل من مجموعة من الأنسجة الدهنية والضام.
- مكان القنينة على الجليد وكرر الخطوة 3 مع الماوس المقبل.
الهضم
- ختم كل قنينة ووضعه في الحمام 37 درجة مئوية في المياه. لاحتضان 13-17 دقيقة (الوقت يختلف مع سلالة وعمر الحيوان).
- بعد الوقت قد انقضى ، يهز قنينة بقوة. ينبغي أن ينهار البنكرياس.
- صب كل هضم من خلال مصفاة كبيرة في بالوعة العقيمة دورق العقيمة مل 1000 و ماصة بقوة خارج الشاشة مع الغسيل العازلة. صرف 50 في هضم أنابيب conicals مل (3 مل أنبوب pancreata/50 : إذا ن = 12 ، واستخدام ما يكفي من غسل العازلة للتأهل الى النهائي حجم 200 مل والاستغناء عن لأنابيب مل 4x50). وينبغي أن يتم التخفيف السريع على الجليد وغير المرغوب فيها لتجنب جزيرة الهضم.
- تدور باستمرار : بدء تشغيل أجهزة الطرد المركزي. عندما تصل إلى 1300 دورة في الدقيقة ، إيقاف تشغيله.
- نضح لطاف ، وترك ~ 5 مل. أن يكون حذرا للغاية حتى لا نضح لبيليه.
- Resuspend بيليه من خلال استغلال بقوة مع يدك ، ثم إضافة 50 مل من غسل العازلة.
- تدور باستمرار : بدء تشغيل أجهزة الطرد المركزي. عندما تصل إلى 1300 دورة في الدقيقة ، إيقاف تشغيله.
- Resuspend وبيليه وتغسل مع 5 مل من العازلة الغسيل.
- نقل 5 مل إلى 15 مل المخروطية وتدور باستمرار ، على النحو الوارد أعلاه.
- نضح في وطاف ممكن تماما. (قد يتسبب في المخزن المتبقي تغيير كثافة Ficoll).
Ficoll
نفذ بسرعة. على المدى الطويل Ficoll التعرض سامة بالنسبة للجزر.
- تأكد مكسورة تماما حتى قبل بيليه مضيفا ficoll (الأنسجة مفصول من الصعب resuspend في ficoll).
- Resuspend الكرية في 7 مل من ficoll ، والكثافة 1.108 ، التي vortexing بقوة.
- طبقة فوق بعضها كثافة 2ml ficoll كل من الكثافة المتبقية في هذا الترتيب : 1.096 ، 1.069 ، 1.037 ثم.
- تدور لمدة 15 دقيقة في 1800 دورة في الدقيقة في 4 درجات ، مع قطع!
- التقاط الجزر من الطبقة الثانية باستخدام spoid (ع العقيمةالشافطة lastic). نقل كافة المجموعات إلى 50 مل تحتوي على 25 مل المخروطية ~ العازلة من البرد.
- يغسل ، على النحو الوارد أعلاه ، و 3 مرات مع العازلة الغسيل (تكرار الخطوة 12-15).
- الفشوت Resuspend في 20 مل RPMI - 1640 (التي تحتوي على 10 ٪ FCS والبنسلين والستربتوميسين ، HEPES ، MEM - NEAA) ومزيج بلطف. إزالة 100 UL عينة لفرز الأصوات.
- نقل 100 UL إلى 35 ملم لوحة الشبكة ، التي تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام وdithizone 1 مل.
- احتضان الجزر المتبقية في RPMI 1640 ، في 37 درجة مئوية ، و 7 ٪ CO 2 حاضنة ، في 160 ملم مع لوحات ما مجموعه 30 مل من وسائل الاعلام / لوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dithizone | reagent | Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed. | ||
| PBS | Buffer | |||
| HBSS | Buffer | |||
| Isolation soln. | Buffer | HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4 | ||
| Wash soln. | Buffer | Isolation buffer containing 1mM CaCl2 | ||
| Collagenase P | Boehringer Ingeheim | 1213873 | ||
| Dissection tools | Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue) | |||
| Syringe | sterile, 5ml, 1/mouse. | |||
| 30 G needles | sterile, 1/syringe | |||
| siliconized glass vials w/Teflon cap | Fisher Scientific | 213-018-54 | sterile, 1/mouse | |
| large sink strainer | sterile | |||
| 1000 ml Beaker | sterile | |||
| Gauze pads | 4x4, 2/mouse | |||
| plastic eye dropper | sterile | |||
| Mice | Animal | |||
