Summary
Protocol
Collagenase הכנה
- תשקלי את collagenase לתוך חיץ 50 מ"ל בידוד חרוטי ולהוסיף להפוך את הריכוז הסופי, כמפורט בטבלה שלהלן. ממיסים את collagenase ידי vortexing.
(12 + 2 עכברים עכברים עכברים תוספת = 14 x 5 מ"ל / עכבר = 70 מ"ל collagenase פתרון מוחלט)
(70 מ"ל x 0.5 מ"ג / מ"ל או 0.3 מ"ג / מ"ל = 35 מ"ג או 21 מ"ג בסך P collagenase)זן גיל Collagenase P (מ"ג / מ"ל) זמן (דקות) C3H, Balb / C, B6 > 12 שבועות 0.8 17 C3H, Balb / C, B6 <= 12 שבועות 0.5 13 מהנהנת, NOR, אי > 12 שבועות 0.8 17 מהנהנת, NOR, אי <= 12 שבועות 0.5 17 - לוותר על 2 מ"ל של תמיסת collagenase לתוך בקבוקון זכוכית בכל מקום על הקרח. טען כל מזרק 5 מ"ל עם 3 מ"ל של מחט collagenase להוסיף 30G מקום בקרח (להכין במנדף).
Distension
- רגע לפני לנתיחה, להקריב בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם. ספריי על כל הגוף עם 70% ETOH, מה שהופך אותו רטוב לגמרי. הפוך V-insision החל באזור אברי המין. סובב את העכבר כך הזנב פונה ממך.
- הסר את המעי לצדו השמאלי של העכבר פתוח. זה יחשוף את הלבלב צינור המרה המשותף.
- מניחים מהדק hemostat משני צדי קטן המעי, שם את צינור המרה מנקז, משאיר כיס קטן לפתרון collagenase להזין את המעי.
- לנפח את הלבלב דרך בצינור המרה עם מחט 30G ו 5 מ"ל במזרק המכיל 3 מ"ל של תמיסת collagenase קר, החל בכיס המרה.
- הסר את הלבלב מהגוף ולמקם אותו בקבוקון siliconized המכיל 2 מ"ל של תמיסת collagenase. צעד זה צריך להיעשות במהירות ככל נקי ככל האפשר, מזעור אוסף של רקמות שומן החיבור.
- מניחים את הצנצנת על קרח שלב 3 לחזור עם העכבר הבא.
עיכול
- חותם כל בקבוקון ולמקם אותו לתוך אמבט 37 ° C-המים. דגירה של 13-17 דקות (הזמן משתנה עם הגיל זן של בעל החיים).
- לאחר זמן שחלף, לנער את הבקבוקון במרץ. הלבלב צריך להתפרק.
- יוצקים כל לעכל דרך מסננת כיור גדול סטרילי לתוך מבחנה סטרילית 1000 מ"ל ו - בכוח פיפטה את המסך עם כביסה חיץ. לוותר מעכל לתוך צינורות conicals 50 מ"ל (3 pancreata/50 צינור מ"ל: אם n = 12, השתמש מספיק כביסה חיץ כדי להפוך את סופי 200 מ"ל נפח ומוציאים אותו לצינורות 4x50 מ"ל). דילול צריך להיעשות במהירות על הקרח, כדי למנוע עיכול איון לא רצויות.
- ספין למטה: הפעל את הצנטריפוגות. כאשר זה מגיע 1300 סל"ד, לכבות אותו.
- לשאוב supernatant, עוזב ~ 5 מ"ל. היה זהיר מאוד שלא לשאוב את הכדור.
- Resuspend גלולה ידי הקשה נמרצות עם היד שלך, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל של חיץ לשטוף.
- ספין למטה: הפעל את הצנטריפוגות. כאשר זה מגיע 1300 סל"ד, לכבות אותו.
- Resuspend גלולה ולשטוף עם 5 מ"ל של חיץ כביסה.
- העברת מ"ל 5-15 מ"ל חרוטי ספין למטה, כאמור לעיל.
- לשאוב supernatant כפי לחלוטין ככל האפשר. (חיץ נותרת עלול לגרום שינוי צפיפות של Ficoll).
Ficoll
בצע במהירות. חשיפה ארוכת טווח Ficoll רעיל איים.
- ודא גלולה שבור לגמרי לפני הוספת ficoll (רקמה רצוף קשה resuspend ב ficoll).
- Resuspend את הכדור בתוך 7 מ"ל של ficoll, צפיפות 1.108, על ידי vortexing במרץ.
- שכבה על גבי צפיפות כל ficoll 2ml של כל אחד צפיפויות הנותרים לפי הסדר הבא: 1.096, 1.069, 1.037 אז.
- ספין במשך 15 דקות ב 1800 סל"ד ב 4 מעלות, עם לנתק!
- פיק איים מן השכבה השנייה בעזרת spoid (p סטריליתהטפטפת lastic). העברת כל האוספים ל 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל חרוטי ~ של חיץ קר.
- שטפי, כאמור לעיל, 3 פעמים עם חיץ כביסה (חוזרת צעד 12-15).
- איי Resuspend ב 20 מ"ל RPMI-1640 (FCS המכיל 10% ו פניצילין וסטרפטומיצין, HEPES, מ-NEAA) ומערבבים בעדינות. הסר ul 100 המדגם עבור לספור.
- העברת 100 ul עד 35 צלחת רשת מ"מ המכילה 1 מ"ל של מדיה 1 dithizone מ"ל.
- דגירה איים שנותרו RPMI 1640, ב 37 ° C, 7% CO 2 באינקובטור, ב 160 מ"מ צלחות עם סך של 30 מ"ל של מדיה / צלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dithizone | reagent | Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed. | ||
| PBS | Buffer | |||
| HBSS | Buffer | |||
| Isolation soln. | Buffer | HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4 | ||
| Wash soln. | Buffer | Isolation buffer containing 1mM CaCl2 | ||
| Collagenase P | Boehringer Ingeheim | 1213873 | ||
| Dissection tools | Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue) | |||
| Syringe | sterile, 5ml, 1/mouse. | |||
| 30 G needles | sterile, 1/syringe | |||
| siliconized glass vials w/Teflon cap | Fisher Scientific | 213-018-54 | sterile, 1/mouse | |
| large sink strainer | sterile | |||
| 1000 ml Beaker | sterile | |||
| Gauze pads | 4x4, 2/mouse | |||
| plastic eye dropper | sterile | |||
| Mice | Animal | |||
