Summary
Protocol
Collagenase तैयारी
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार जोड़ने और अलगाव के लिए अंतिम एकाग्रता के रूप में नीचे तालिका में संकेत बनाने के लिए बफर में collagenase वजन. Vortexing द्वारा collagenase भंग.
(12 चूहों + 2 अतिरिक्त चूहों = 14 चूहों x 5 / एमएल माउस = 70 मिलीलीटर कुल collagenase समाधान)
(70 मिलीलीटर x 0.5 मिलीग्राम / एमएल या collagenase पी कुल 0.3 मिलीग्राम / एमएल = 35 मिलीग्राम या 21 मिलीग्राम)तनाव आयु Collagenase पी (मिलीग्राम / एमएल) समय (मिनट) C3H Balb, / सी, बी -6 > 12 सप्ताह 0.8 17 C3H Balb, / सी, बी -6 <= 12 सप्ताह 0.5 13 इशारा, न ही गैर, > 12 सप्ताह 0.8 17 इशारा, न ही गैर, <= 12 सप्ताह 0.5 17 - प्रत्येक गिलास और बर्फ पर शीशी जगह में collagenase समाधान के 2 मिलीलीटर बग़ैर. Collagenase ऐड 30g सुई और बर्फ में जगह (हुड में तैयार) के 3 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक 5 मिलीलीटर सिरिंज लोड.
बढ़ाव
- विच्छेदन बस से पहले, गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा पशु बलि. ETOH के 70% के साथ पूरे शरीर स्प्रे, यह पूरी तरह से गीला बना. जननांग क्षेत्र में शुरू वी insision बनाओ. माउस घुमाएँ तो पूंछ तुम से दूर का सामना करना पड़ रहा है.
- खुले माउस के बाईं ओर करने के लिए आंत्र निकालें. यह अग्न्याशय और आम पित्त नली का खुलासा होगा.
- छोटे आंतों, जहां पित्त नली नालियों के दोनों तरफ एक hemostat दबाना प्लेस, collagenase समाधान के लिए एक छोटी सी जेब छोड़ने के लिए आंत में प्रवेश.
- एक 30g सुई और 5 मिलीलीटर सिरिंज ठंड collagenase समाधान के 3 मिलीग्राम से युक्त के साथ पित्त नली के माध्यम से बढ़ अग्न्याशय, पित्ताशय में शुरू.
- शरीर से अग्न्याशय निकालें और यह एक siliconized collagenase समाधान के 2 मिलीलीटर युक्त शीशी में जगह है. यह कदम जल्दी और के रूप में संभव के रूप में सफाई, वसा और संयोजी ऊतक का संग्रह कम किया जाना चाहिए.
- अगले माउस के साथ बर्फ और दोहराने कदम 3 पर शीशी में रखें.
पाचन
- प्रत्येक शीशी सील और यह एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जगह. 13-17 मिनट (समय तनाव और जानवर की उम्र के साथ बदलती रहती है) के लिए सेते हैं.
- समय बीत जाने के बाद, शीशी सख्ती हिला. अग्न्याशय के अलावा गिर चाहिए.
- एक बड़े बाँझ सिंक झरनी के माध्यम से प्रत्येक पचाने में एक बाँझ 1000 मिलीलीटर बीकर में डालो और जबरदस्ती बंद बफर धोने के साथ स्क्रीन विंदुक. बांटना 50 मिलीलीटर conicals ट्यूबों में हज़म (3 pancreata/50 मिलीलीटर ट्यूब: यदि n = 12, पर्याप्त बफर धोने के लिए अंतिम मात्रा 200 मिलीग्राम और यह 4x50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए बग़ैर) का उपयोग करें. तेजी से कमजोर पड़ने और बर्फ पर किया जाना चाहिए अवांछित आइलेट पाचन से बचने के.
- नीचे स्पिन: अपकेंद्रित्र प्रारंभ. जब यह 1300 rpm पहुँचता है, इसे बंद.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate, ~~ 5 एमएल छोड़ने. बहुत सावधान रहो गोली नहीं aspirate.
- Resuspend गोली अपने हाथ के साथ सख्ती से दोहन द्वारा, तो धो बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें.
- नीचे स्पिन: अपकेंद्रित्र प्रारंभ. जब यह 1300 rpm पहुँचता है, इसे बंद.
- Resuspend धोने बफर के 5 मिलीलीटर के साथ गोली और धोने.
- 15 मिलीलीटर शंक्वाकार 5 मिलीलीटर स्थानांतरण और नीचे स्पिन, जैसा कि ऊपर.
- सतह पर तैरनेवाला के रूप में संभव के रूप में पूरी तरह से Aspirate. (शेष बफर Ficoll के घनत्व के परिवर्तन का कारण हो सकता है.)
Ficoll
जल्दी प्रदर्शन करना. लंबी अवधि के Ficoll जोखिम islets के लिए विषाक्त है.
- यकीन है कि गोली पूरी तरह टूट गया है ficoll (अटूट ऊतक ficoll में resuspend मुश्किल है) जोड़ने से पहले.
- Ficoll, घनत्व 1.108, 7 मिलीलीटर में सख्ती vortexing से गोली Resuspend.
- 1.096, 1.069, तो 1.037: इस क्रम में शेष घनत्व के प्रत्येक के ficoll 2ml से प्रत्येक के घनत्व के शीर्ष पर परत.
- 4 डिग्री पर 1800 rpm पर 15 मिनट के लिए स्पिन के साथ बंद तोड़ने !
- दूसरी परत का उपयोग spoid (बाँझ पी से islets उठाओlastic eyedropper). एक 50 मिलीलीटर ठंड बफर के शंक्वाकार युक्त ~ 25 एमएल के लिए सभी संग्रह स्थानांतरण.
- के रूप में ऊपर, धोने बफर (15/12 कदम दोहरा) के साथ 3 बार धो.
- Resuspend Islets में 20 मिलीलीटर RPMI 1640 (10% FCS और पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, HEPES सदस्य NEAA युक्त) और मिश्रण धीरे. गणना के लिए 100 नमूने के उल निकालें.
- 35 मिमी मीडिया और 1 मिलीलीटर dithizone के 1 मिलीग्राम से युक्त ग्रिड प्लेट के लिए 100 उल स्थानांतरण.
- RPMI 1640 में शेष islets सेते हैं, एक 37 डिग्री सेल्सियस, 7% सीओ 2 इनक्यूबेटर में मीडिया / प्लेट के 30 मिलीलीटर की एक कुल के साथ 160 मिमी प्लेट में,.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dithizone | reagent | Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed. | ||
| PBS | Buffer | |||
| HBSS | Buffer | |||
| Isolation soln. | Buffer | HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4 | ||
| Wash soln. | Buffer | Isolation buffer containing 1mM CaCl2 | ||
| Collagenase P | Boehringer Ingeheim | 1213873 | ||
| Dissection tools | Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue) | |||
| Syringe | sterile, 5ml, 1/mouse. | |||
| 30 G needles | sterile, 1/syringe | |||
| siliconized glass vials w/Teflon cap | Fisher Scientific | 213-018-54 | sterile, 1/mouse | |
| large sink strainer | sterile | |||
| 1000 ml Beaker | sterile | |||
| Gauze pads | 4x4, 2/mouse | |||
| plastic eye dropper | sterile | |||
| Mice | Animal | |||
