Murino pancreatica isolamento Islet

Summary

Protocol

Collagenasi Preparazione

1. Pesare la collagenasi in un buffer 50 isolamento ml e aggiungere per rendere la concentrazione finale, come indicato nella tabella sottostante. Sciogliere il collagenasi vortexando.
   
   
   (12 + 2 topi topi topi in più = 14 x 5 ml / mouse = 70 ml di soluzione di collagenasi totale)
   
   
   (70 ml x 0,5 mg / ml o 0,3 mg / ml = 35 mg o 21 mg del totale collagenasi P)
   
   
   

   Tensione	Età	Collagenasi P (mg / ml)	Tempo (min)
   C3H, Balb / C, B6	> 12 settimane	0,8	17
   C3H, Balb / C, B6	<= 12 settimane	0,5	13
   NOD, NOR, NON	> 12 settimane	0,8	17
   NOD, NOR, NON	<= 12 settimane	0,5	17

   
   
   
2. Dispensare 2 ml di soluzione di collagenasi in ogni fiala di vetro e posto sul ghiaccio. Caricare ogni siringa da 5 ml con 3 ml di aghi 30g collagenasi aggiungere e mettere in ghiaccio (la preparazione in cappa).

Dilatazione

1. Poco prima dissezione, sacrificio animale per dislocazione cervicale. Spruzzare tutto il corpo con il 70% dei ETOH, rendendolo completamente bagnato. Fare un V-Insision a partire dalla zona genitale. Ruotare il mouse in modo la coda è rivolto verso di voi.
2. Rimuovere l'intestino verso il lato sinistro del mouse aperta. Questo esporrà il pancreas e del dotto biliare comune.
3. Posizionare una pinza emostatica su entrambi i lati del piccolo-intestinale, dove il dotto biliare fognature, lasciando una piccola tasca per soluzione collagenasi entrare l'intestino.
4. Gonfiare il pancreas attraverso il dotto biliare con un ago 30g e siringa da 5 ml contenente 3 ml di soluzione di collagenasi a freddo, a partire dalla cistifellea.
5. Rimuovere il pancreas dal corpo e posizionarlo in un flaconcino siliconata contenente 2 ml di soluzione di collagenasi. Questo passo dovrebbe essere fatto rapidamente e in modo pulito possibile, riducendo al minimo la raccolta di grasso e tessuto connettivo.
6. Posizionare il flaconcino su ghiaccio e ripetere il passo 3 con il mouse successiva.

Digestione

1. Sigillare ogni fiala e collocarlo in un 37 ° C bagnomaria. Incubare per 13-17 minuti (il tempo varia con sforzo e l'età dell'animale).
2. Dopo il tempo è trascorso, agitare il flacone energicamente. Il pancreas dovrebbe cadere a pezzi.
3. Versare ogni digestione attraverso un colino grande dissipatore di sterile in un bicchiere da 1000 ml, sterile e con forza pipetta fuori dallo schermo con il tampone di lavaggio. Erogare il digerisce in 50 ml provette conicals (3 pancreata/50 tubo ml: se n = 12, basta utilizzare il tampone di lavaggio per rendere il volume finale 200 ml e dispensare a tubi 4x50 ml). La diluizione deve essere fatta rapidamente e in ghiaccio per evitare indesiderate digestione isolotto.
4. Spin down: Avviare la centrifuga. Quando raggiunge 1300 rpm, spegnerlo.
5. Aspirare il sopranatante, lasciando ~ 5 ml. Essere molto cauti a non aspirare il pellet.
6. Risospendere le sfere toccando vigorosamente con la mano, poi aggiungere 50 ml di tampone di lavaggio.
7. Spin down: Avviare la centrifuga. Quando raggiunge 1300 rpm, spegnerlo.
8. Risospendere il pellet e lavare con 5 ml di soluzione di lavaggio.
9. Trasferire il 5 ml a 15 ml e spin down, come sopra.
10. Aspirare il surnatante modo più completo possibile. (Buffer rimanente potrebbe causare la variazione della densità del Ficoll).

Ficoll

Eseguire rapidamente. Esposizione a lungo termine Ficoll è tossico per gli isolotti.

1. Assicurarsi pellet è completamente rotto prima di aggiungere Ficoll (tessuto ininterrotta è difficile da risospendere in Ficoll).
2. Risospendere il pellet in 7 ml di Ficoll, densità 1,108, vortexando vigorosamente.
3. Strati l'uno sopra l'densità di Ficoll 2 ml di ciascuna delle densità rimanenti in questo ordine: 1,096, 1,069, quindi 1,037.
4. Spin per 15 minuti a 1800 rpm a 4 gradi, con pausa OFF!
5. Scegli isolotti del secondo livello utilizzando spoid (sterili pcontagocce Lastic). Trasferire tutte le collezioni ad una conica da 50 ml contenente circa 25 ml di tampone a freddo.
6. Lavare, come sopra, 3 volte con tampone di lavaggio (ripetendo il passaggio 12-15).
7. Isolotti Risospendere in 20 ml di RPMI-1640 (contenente 10% FCS e la penicillina e la streptomicina, HEPES, MEM-NEAA) e mescolare delicatamente. Rimuovere 100 ul di campione per il conteggio.
8. Trasferire 100 ul a 35 mm Griglia piastra contenente 1 ml di media e 1 ditizone ml.
9. Incubare isolotti rimanenti in RPMI 1640, a 37 ° C, 7% di CO ₂ incubatore, in 160 piastre mm con un totale di 30 ml di media / piastra.
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal