Summary
Protocol
コラゲナーゼ準備
- 下の表に示すように、最終濃度を、作るために50 mlコニカル及び追加の絶縁バッファにコラゲナーゼを秤量。ボルテックスによりコラゲナーゼを溶かす。
（12匹+ 2余分なマウス= 14マウス× 5 0.2ml /マウス= 70ミリリットルトータルコラゲナーゼ溶液）
（70ミリリットル× 0.5 mg / mlまたはコラゲナーゼPの合計の0.3 mg / mlの= 35 mgまたは21 mg）をひずみ 年齢 コラゲナーゼP（mg / ml）を 時間（分） C3H、BALB / C、B6 > 12週間 0.8 17 C3H、BALB / C、B6 <= 12週間 0.5 13 NOD、NOR、NON > 12週間 0.8 17 NOD、NOR、NON <= 12週間 0.5 17 - 氷の上でそれぞれのガラスバイアルと所定の位置にコラゲナーゼ溶液2 mlを分注する。コラゲナーゼを追加30gの針と氷の場所（フードで準備）3mlで各5mlシリンジをロードする。
膨張
- ちょうど解剖前に、頚椎脱臼により動物を生け贄に捧げる。それは完全に濡れており、ETOHの70％で全身にスプレーしてください。陰部から始まるV - insisionを行います。尾があなたから離れて向くようにマウスを回転させる。
- オープンマウスの左側の腸を削除します。これは、膵臓と総胆管を公開します。
- 胆管が腸を入力するコラゲナーゼ溶液のための小さなポケットを残し、排水溝小腸のいずれかの側の止血クランプを、置きます。
- 胆嚢から始まる、冷たいコラゲナーゼ溶液3 mlを入れた30グラムの針と5mlシリンジと胆管を介して膵臓を膨らませる。
- 体から膵臓を削除し、コラゲナーゼ溶液2 mlを含むシリコン処理バイアルに入れてください。このステップは、脂肪と結合組織のコレクションを最小限に抑え、 迅速かつとしてきれいに可能な限り実行する必要があります。
- 次のマウスを使って氷を繰り返し、手順3でバイアルを置きます。
消化
- 各バイアルを密封し、37℃の水浴中に入れてください。 13〜17分（時間は、動物の系統と年齢によって異なります）インキュベートする。
- 時間が経過した後、精力的にバイアルを振る。膵臓はバラバラになるはず。
- 無菌1000 mlのビーカーに大規模な滅菌シンクストレーナーを通してそれぞれのダイジェストを注ぐと強制的に洗浄バッファーに画面をオフにピペット。 50ミリリットルconicals管（：N = 12は、最終容量を200 mlを加えると4x50 mlチューブに分注するために十分な洗浄バッファーを使用する場合は3 pancreata/50 mlのチューブ）にダイジェストを分注する。希釈が不要な膵島の消化を防ぐために迅速かつ氷上で行われる必要があります。
- スピンダウン：遠心分離機を開始します。それが1300回転に達すると、それをオフにしてください。
- 〜5 mLを残し、上清を吸引除去する。ペレットを吸引しないように非常に慎重である。
- あなたの手で激しくタップしてペレットを再懸濁しますが、その後、洗浄緩衝液50 mlを加える。
- スピンダウン：遠心分離機を開始します。それが1300回転に達すると、それをオフにしてください。
- ペレットを再懸濁し、洗浄バッファー5 mlで洗浄する。
- 15 mlコニカルに5 mlを転送し、上記のように、スピンダウン。
- できる限り完全に上清を吸引除去する。 （残りのバッファは、フィコール密度の変化を引き起こす可能性があります。）
フィコール
すぐに実行します。長期的フィコール曝露は小島に対して毒性が強い。
- ペレットが完全に前に追加フィコール（切れ目のない組織は、フィコールで再懸濁することが困難である）に分割されていることを確認します。
- 精力的にボルテックスでフィコール、密度1.108、7mlにペレットを再懸濁する。
- その後、1.096、1.069、1.037：この順序で残りの密度のそれぞれのフィコール2ミリリットルの各密度の上の層。
- OFF破ると 、4℃で1800rpmで15分間スピン！
- spoid（無菌pを使用して2番目の層からの膵島を選ぶラスチックスポイト）。冷緩衝液の50 mlコニカル含む〜25 mLにすべてのコレクションを転送する。
- 洗浄バッファー（ステップ12から15を繰り返す）と、上記のように、3回洗浄する。
- 再懸は20ミリリットルRPMI - 1640でレッツ（10％FCSおよびペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、HEPES、MEM - NEAA）、穏やかに混合する。カウントのためのサンプル100 ulを削除します。
- メディアと1 mlのジチゾン1 mlを含む、35 mmのグリッドプレートに100 ulを転送する。
- メディア/プレートを30mlの合計160 mmプレートで、37℃、7％CO 2インキュベータ内で、RPMI 1640に残っている島をインキュベートする。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dithizone | reagent | Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed. | ||
| PBS | Buffer | |||
| HBSS | Buffer | |||
| Isolation soln. | Buffer | HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4 | ||
| Wash soln. | Buffer | Isolation buffer containing 1mM CaCl2 | ||
| Collagenase P | Boehringer Ingeheim | 1213873 | ||
| Dissection tools | Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue) | |||
| Syringe | sterile, 5ml, 1/mouse. | |||
| 30 G needles | sterile, 1/syringe | |||
| siliconized glass vials w/Teflon cap | Fisher Scientific | 213-018-54 | sterile, 1/mouse | |
| large sink strainer | sterile | |||
| 1000 ml Beaker | sterile | |||
| Gauze pads | 4x4, 2/mouse | |||
| plastic eye dropper | sterile | |||
| Mice | Animal | |||
