Biology

Isolamento Islet murino de pâncreas

Published: August 22, 2007 doi: 10.3791/255

Gregory L. Szot¹, Pavel Koudria¹, Jeffrey A. Bluestone¹

¹Diabetes Center, University of California, San Francisco - UCSF

Summary

Protocol

Preparação colagenase

Pesar a colagenase em um buffer de 50 ml de isolamento ml e juntar para fazer a concentração final, conforme indicado na tabela abaixo. Dissolver a colagenase em vortex.

(12 + 2 ratos ratos extra = 14 ratos x 5 ml / mouse = 70 ml de solução de colagenase total)

(70 ml x 0,5 mg / ml ou 0,3 mg / ml = 35 mg ou 21 mg de colagenase total P)

Tensão	Idade	Colagenase P (mg / ml)	Tempo (min)
C3H, Balb / C, B6	> 12 semanas	0,8	17
C3H, Balb / C, B6	<= 12 semanas	0,5	13
NOD, NOR, NÃO	> 12 semanas	0,8	17
NOD, NOR, NÃO	<= 12 semanas	0,5	17

Dispense 2 ml de solução de colagenase em cada frasco de vidro e colocar no gelo. Carregar cada seringa de 5 ml com 3 ml de colagenase agulha 30g adicionar e coloque em gelo (preparar na capa).

Distensão

Pouco antes de dissecção, o sacrifício de animais por deslocamento cervical. Pulverizar o corpo inteiro com 70% de álcool etílico, tornando-o completamente molhado. Faça uma V-Insision começando na área genital. Girar o mouse para a cauda está enfrentando longe de você.
Retire do intestino para o lado esquerdo do mouse em aberto. Isto irá expor o pâncreas e do duto biliar comum.
Coloque uma pinça hemostática de cada lado do intestino delgado, onde o ducto biliar drenos, deixando uma pequena bolsa para solução de colagenase a entrar no intestino.
Inflar o pâncreas através do ducto biliar com uma agulha 30g e seringa de 5 ml contendo 3 ml de solução de colagenase frio, a partir da vesícula biliar.
Remover o pâncreas do corpo e colocá-lo em um frasco siliconizado contendo 2 ml de solução de colagenase. Esta etapa deve ser feito rapidamente e tão limpa quanto possível, minimizando coleção de gordura e tecido conjuntivo.
Coloque o frasco sobre o gelo e 3 repita o passo com o mouse que vem.

Digestão

Seal cada frasco e coloque-o a 37 ° C em banho-maria. Incubar durante 13-17 minutos (o tempo varia com a tensão ea idade do animal).
Após o tempo decorrido, agite o frasco vigorosamente. O pâncreas devem desmoronar.
Despeje cada digestão através de um filtro estéril, pia grande em um copo ml estéril 1000 e com força pipeta fora da tela com tampão de lavagem. Dispense o digere em tubos de 50 ml conicals (3 ml tubo pancreata/50: se n = 12, use o suficiente lavar buffer para fazer a final do volume 200 ml e fornecê-las para tubos 4x50 ml). A diluição deve ser feito rapidamente e com gelo para evitar a digestão das ilhotas indesejados.
Spin down: Iniciar a centrífuga. Quando se chega a 1300 rpm, desligá-lo.
Aspirar o sobrenadante, deixando ~ 5 mL. Tenha muito cuidado para não aspirar o sedimento.
Ressuspender pellet tocando vigorosamente com a mão, em seguida, adicione 50 ml de tampão de lavagem.
Spin down: Iniciar a centrífuga. Quando se chega a 1300 rpm, desligá-lo.
Ressuspender o sedimento e lavar com 5 ml de tampão de lavagem.
Transferir os 5 ml a 15 ml cônico e spin down, como acima.
Aspirar o sobrenadante forma mais completa possível. (Buffer restante pode causar a mudança de densidade do Ficoll).

Ficoll

Executar rapidamente. Exposição a longo prazo Ficoll é tóxico para ilhotas.

Certifique-se de pellet é completamente quebrado antes de adicionar Ficoll (tecido intacto é difícil de ressuspender em Ficoll).
Ressuspender o sedimento em 7 ml de Ficoll, a densidade de 1,108, em vortex vigorosamente.
Camada em cima de cada densidade de Ficoll 2ml de cada uma das densidades restantes na seguinte ordem: 1,096, 1,069, 1,037, em seguida.
Giro por 15 minutos a 1800 rpm a 4 graus, com quebra OFF!
Escolha ilhotas da segunda camada utilizando spoid (p estérilconta-gotas lastic). Transferência de todas as coleções para um contendo 50 ml ~ cônico 25 mL de tampão frio.
Lavagem, como acima, 3 vezes com tampão de lavagem (repetindo a etapa 12-15).
Ilhotas ressuspender em 20 ml RPMI-1640 (contendo 10% SFB e penicilina e estreptomicina, HEPES, MEM-NEAA) e misture delicadamente. Retirar 100 ul de amostra para contagem.
Transferir 100 ul a 35 placa Grid-mm contendo 1 ml de mídia e um ditizona ml.
Incubar ilhotas restante em RPMI 1640, em um 37 ° C, 7% incubadora de CO _2, em 160 mm, com placas de um total de 30 ml de media / prato.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal