Murina Pancreatic Islet Isolation

Summary

Protocol

Kollagenas Förberedelser

1. Väg ut kollagenas i en 50 ml konisk och lägga isolering buffert för att göra den slutliga koncentrationen, som framgår av tabellen nedan. Lös kollagenas genom att vortexa.
   
   
   (12 möss + 2 extra möss = 14 möss x 5 ml / mus = 70 ml totalt kollagenas lösning)
   
   
   (70 ml x 0,5 mg / ml eller 0,3 mg / ml = 35 mg eller 21 mg av kollagenas P totalt)
   
   
   

   Sila	Ålder	Kollagenas P (mg / ml)	Tid (min)
   C3H, BALB / C, B6	> 12 veckor	0,8	17
   C3H, BALB / C, B6	<= 12 veckor	0,5	13
   NOD, NOR, ICKE	> 12 veckor	0,8	17
   NOD, NOR, ICKE	<= 12 veckor	0,5	17

   
   
   
2. Tillsätt 2 ml kollagenas lösning i varje injektionsflaska av glas och lägg på is. Ladda Varje 5 ml spruta med 3 ml kollagenas lägga 30g nål och placera i is (förbereda i huva).

SVÄLLANDE

1. Strax före dissekering, uppoffring animaliska halsdislokation. Spraya hela kroppen med 70% EtOH, vilket gör den helt blöt. Gör ett V-insision börjar vid underlivet. Rotera musen så svansen är vänd bort från dig.
2. Ta bort tarmen på vänster sida av den öppna musen. Detta kommer att utsätta den bukspottkörteln och gallgången.
3. Placera en hemostat klämma på vardera sidan av den lilla-tarm, där gallgången avlopp, vilket ger en liten ficka för kollagenas lösning att komma in i tarmen.
4. Blås bukspottkörteln genom gallgången med en 30g nål och 5 ml spruta innehållande 3 ml kall kollagenas lösning, med början vid gallblåsan.
5. Ta bort bukspottkörteln från kroppen och placera den i en silikoniserad injektionsflaska innehållande 2 ml kollagenas lösning. Detta steg bör ske snabbt och så rent som möjligt, minimera samling av fett och bindväv.
6. Placera flaskan på is och upprepar steg 3 med nästa musen.

Matsmältning

1. Seal varje flaska och placera den i en 37 ° C vattenbad. Inkubera i 13-17 minuter (tiden varierar med stam och djurets ålder).
2. Efter tiden har gått, skaka flaskan kraftigt. Bukspottkörteln skulle falla isär.
3. Häll varje smälta genom ett stort sterilt sjunka sil i en steril 1000 ml bägare och kraftfullt pipett utanför skärmen med tvätt buffert. Fördela den smälter in i 50 ml conicals rör (3 pancreata/50 ml tub: om n = 12, använder nog tvätt buffert för att göra den slutliga volymen 200 ml och fördela den till 4x50 ml rör). Utspädningen bör ske snabbt och på is för att undvika oönskade holme matsmältningen.
4. Spinn ner: Starta centrifugen. När den når 1300 rpm, stänga av den.
5. Aspirera supernatanten, lämnar ~ 5 ml. Var mycket försiktig att inte aspirera pelleten.
6. Resuspendera pellet genom att knacka kraftigt med handen, och tillsätt sedan 50 ml tvättbuffert.
7. Spinn ner: Starta centrifugen. När den når 1300 rpm, stänga av den.
8. Suspendera pelleten och tvätta med 5 ml tvätt buffert.
9. Överför 5 ml till 15 ml koniska och spinn ner, som ovan.
10. Aspirera supernatanten så fullständigt som möjligt. (Återstående buffert kan orsaka en förändring av tätheten av Ficoll.)

Ficoll

Utför snabbt. Långvarig Ficoll exponering är giftigt för holmar.

1. Se till att pellets är helt bryts upp innan du lägger Ficoll (obruten vävnad är svårt att återsuspendera i Ficoll).
2. Återsuspendera pelleten i 7 ml Ficoll, densitet 1,108, genom att vortexa kraftigt.
3. Lager på toppen av varje täthet av Ficoll 2 ml av varje av de återstående tätheter i följande ordning: 1,096, 1,069, då 1,037.
4. Spin i 15 minuter vid 1800 rpm vid 4 grader, med bryta!
5. Välj skär från den andra lager med spoid (sterila plastic pipett). Överför alla samlingar till en 50 ml konisk innehåller ~ 25 ml kallt buffert.
6. Tvätta, som ovan, 3 gånger med tvätt buffert (upprepa steg 12-15).
7. Resuspendera holmar i 20 ml RPMI-1640 (innehållande 10% FCS och penicillin och streptomycin, HEPES, MEM-NEAA) och blanda försiktigt. Ta bort 100 ul av provet för att räkna.
8. Överför 100 ul till 35 mm Grid-skylt som innehåller 1 ml av media och 1 ml dithizone.
9. Inkubera kvarvarande holmar i RPMI 1640, i ett 37 ° C, 7% CO ₂ inkubator, i 160 mm plattor med sammanlagt 30 ml av media / platta.
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal