Summary
우리는 포털 깡패 폐색에 대한 교수형 체중 시스템의 소설 murine 모델을 설립했습니다. 이 기술은 murine 간장 모델에서 국소 빈혈의 향후 수사 유용할 수 있습니다.
Abstract
국소 빈혈로 인한 급성 간 손상은 여러 임상 절차 예 : 간 이식, 간장 종양의 절제술 또는 외상 수리하는 동안 발생할 수 있으며, 높은 사망률 1-2가 간경화가 발생할 수 있습니다. 간장 국소 빈혈에 따라서 murine 연구 pharmacological 및 유전자 연구에게 3-9를 활용할 수있는 기회를 제공함으로써 연구의 중요한 분야가되었습니다. 특히, 유전자의 조직이 구체적인 삭제와 조건부 생쥐 (cre, flox 시스템)은 특정 조직 10-13에서 단백질의 역할에 통찰력을 제공합니다. 때문에 수동으로 생쥐에서 포털 깡패를 클램핑과 관련된 기술적인 어려움으로 인해 우리는 이전에 3을 설명했습니다 포털 트라이 어드의 폐색에 대한 교수형 - 무게 시스템을 사용하여 체계적인 평가를 수행했습니다. 교수형 - 체중 시스템을 사용함으로써 우리는 또한 이후 간장 엽 (叶) 손상을 유발하지 않고도 포털 트라이 어드의 왼쪽 지점 주위 봉합 배치가능한 최고의 클램프로 인해 혈관에 간 조직의 가까운 위치에 간장 조직의 손상을 일으킬 수 있습니다. 더욱이, 간성 트라이 어드의 오른쪽 지점은 여전히 따라서 perfused 더 창자 정체 보존되며 오른쪽 간장 엽 (叶)으로 혈액의 흐름으로이 기법으로 발생하지 않습니다. 또한, 포털 깡패는 전체 수술에 걸쳐 한번에 조작할 수 있습니다. 따라서 절차를 쉽게 수행할 수 있으며, 국소 빈혈과 reperfusion의 짧은 시간으로 미리 에어컨을 좋아해요. 알라닌 (ALT)와 aspartate (대서양 표준시) 아미노 전이 효소 혈청 수준 3,9으로 측정으로 다양한 국소 빈혈과 reperfusion 시간을 수행하여이 모델의 체계적인 평가는 간 손상과 간장 국소 빈혈 시간 가까운 상관 관계를 밝혔다. 간장 국소 빈혈과 간헐 reperfusion 위해 보내야-체중 시스템을 사용할 때 함께 찍은,이 연구는 높은 재현성 간 부상을 확인합니다. 따라서이 기법은 다른 수사관에 관심을 가져 주셔서 유용할 수 있습니다생쥐의 간 국소 빈혈 연구의 에드. 따라서 비디오 클립이 기술에 대한 자세한 단계별 설명을 제공합니다.
Protocol
일반 발언. 모든 작업은 직립 해부 현미경 (Leica) 아래와 외과 coagulator를 사용하여 수행해야합니다. 실험 및 사기 집단의 쥐들이 결과의 comparability을 보장하기 위해 연령과 체중에 일치해야합니다. 온도, 혈압, 마취 및 유체 관리는 안정적이고 전체 실험 기간 동안 모니터링해야합니다.
1. 마취 및 수술
- C57BL / 6 마우스 10~16주의 연령 범위 내에 있어야합니다 그리고 그들은 성별 - 검색된 각각의 그룹에 있어야합니다.
- pentobarbital 나트륨 (70 밀리그램 / kg 체중의 IP)로 생쥐를 마취 약으로 마취를 유지합니다. 10 MG / ㎏ / H 나트륨 pentobarbital. 치사량에 도달 크게 혈압을 낮출 수 있으며 따라서 결과를 변경할 수 있습니다.
- 직장 체온계 프로브와 온도 조절 온수 테이블 (RT, Effenberg, 뮌헨, 독일)의 장소 마우스 열 피드백에 부착된37시 체온을 유지하기 위해 컨트롤러 ° C.
- 이동식 테이프와 함께 테이블에 부착된 위턱과 아래턱에 사지와 수술 테이블에 위로 향한 위치에 플레이스 마우스,.
- 생존 실험의 경우 머리카락 클리핑, iodophors (예 : Betadine), autoclaved 악기 멸균 처리, 그리고 마스크에게 의사를위한 멸균 장갑을 사용으로 피부의 소독을 포함한 적절한 무균 기법이 필요합니다.
2. 포털 트라이 어드 폐색
- 피부를 절단하기 때문에 마우스 헤어 알레르기의 위험을 방지하여 마우스 머리카락 흡입을 방지하기 위해 미네랄 오일과 함께 절개 영역을 커버. 당신이 쉽게 간을 노출될 수 있도록 최대 상부 끝까지 linea 알바의 중간선 개복술과 절개를 수행합니다. 가능하면은 출혈을 방지하기 위해 응고 전극 (Erbe, ICC50, Tuebingen, 독일)와 절개를 수행합니다.
- 꼬리가 direc이라는 위치에 마우스로 가열 테이블을 놓으십시오외과 의사로 테드. 그 위치는 깡패를 집중하고 봉합을 배치하는 가장 좋은 설정을 제공합니다.
- 포털 깡패를 폭로 젖은 솜 팁 면봉을 사용하여 오른쪽에 소장을 치환.
- 약간 피임기구에 대한 평균과 왼쪽 엽과 소장에 대한 권리 엽을 바꾸다. 그게 당신에게 오른쪽, 왼쪽 / 중간 엽 (叶)의 분기점 위 포털 트라이 어드의 명확한 전망을 제공합니다.
- 조심스럽게 포털 깡패를 검사하고 개성이 집게로 조심스럽게 내려 오른쪽 귓불을 누르고 있습니다. 그게 당신에게 왼쪽 포털 트라이 어드에서 멋진 전망을 제공합니다.
- 왼쪽에서 오른쪽으로 간장 동맥, 간장 정맥, 그리고 담즙 덕트 포함하여 왼쪽 포탈 깡패 밑에 바늘 홀더, 경유, 일단 시각적으로 봉합사 (Ethicon, Norderstedt, 독일 7 / 0 나일론 봉합사)로 장소에게 바늘을 식별 마우스.
- 스티치는 깡패 아래 긴밀하게 될 수 있습니다. 깊은 스티치는 아래에있는 베나 휴가 열등 다칠 수깡패. 따라서 바늘을 배치하기 전에 대정 맥을 식별하는 데 포셉으로 오른쪽 간 엽 (叶)을 누르십시오.
- 집게와 함께 오른쪽에있는 바늘의 팁을 가지고 간 손상없이 간 영역의 밖으로 부드럽게 당기십시오.
- 봉합 Eppendorf 튜브 (물이 담겨있는 약 3g)의 각 끝에 부착하고 두 봉합은 봉합 소지자 이상 종료 놓으십시오. 봉합사는 바로 트라이 어드에 방해가되지 않도록 distally 바늘의 봉합 홀더를 놓습니다.
- 가중치를 적용하여 트라이 어드는 간을의 왼쪽과 중간 엽 (叶)에 대한 혈액 공급의 중단을 초래 즉시 occluded 될 것입니다. 성공적인 폐색 쉽게 허혈성 엽 (叶)의 창백 창백 시각적으로 검사하여 확인할 수 있습니다. 매달려 무게가 기둥에서 발표되고 간장이 reperfused 때 대조적으로, 색상의 변화가 즉시 사라집니다. 이 부분 간장 국소 빈혈 모델 bloo을 보존하여 mesenteric 혼잡을 피할 수우측 간 엽 (叶)으로 D 흐름.
- 복강에 소장을 교체하십시오. 37.0에서 물이 흥건히 젖은 면봉으로 간, 대장의 따뜻한 유지 ° C. 수술을 마치고 상용 식품 포장지에 쥐 커버 체온이 안정 유지하는 이외에.
- 실험 프로토콜에 따라 필요에 따라 국소 빈혈을 수행합니다. 정의된 국소 빈혈 시간 릴리스 후 평균과 왼쪽 간 엽 (叶)의 무게와 reperfusion가 즉시 시작됩니다. 이 기술은 생쥐에서 가역 국소 빈혈을 제작하실 수 있습니다. 더 이상의 국소 빈혈 시간이 수행되지 않을 경우주의 깊게 봉합사를 제거합니다.
- 15 분 전에 직접 reperfusion 후 복강으로 약 400 μl 나트륨 염화물을 추가합니다. reperfusion 시간 동안 유체 손실을 보상하기 위해 100 μl의 금액에서 30 분 간격으로 액체를 대체할 계속합니다.
- 생존 실험의 경우 수술 상처는 지속적인 근육 벽 봉합과 피부 WI를 사용 닫힙니다4 / 0 봉합 일.
3. 간 관류의 변화
다음과 같은 결과 매개 변수 간 부상 다음 간장 국소 빈혈을 결정하기 위해 권장합니다 :
간 효소 (예 : ALT, 대서양 표준시)와 간 조직학 (H & E 염색법) 다음과 같은 간 국소 빈혈과 reperfusion 3,9를 결정합니다.
그림 1 간 국소 빈혈에 대한 교수형 - 무게 시스템의 모델 :. 매달려 체중 시스템이 왼쪽과 중간 엽 3 간 국소 빈혈을 유발하기 위해 설립되었습니다. () 따라서 꼬리가있는 오른쪽 엽은 부드럽게 왼쪽 엽에서 분리되었다. 바로 기억 상실증이 분명 오른쪽 중간 좌우 엽 (叶)의 분기점 위 포털 깡패를 보려면 다음 약간 이동했습니다. 8.0 나일론 봉합사는 왼쪽 간장 깡패 아래에 배치되었다. (B) 각각의 봉합사의 끝에 작은 무게 (시 3g Eppendorf 부엉물이 가득 bes)을 첨부와 적용되었습니다. 간장 국소 빈혈이 빨간색에서 연한에 왼쪽과 중간 엽의 색깔 변화로 볼 수 있습니다. 이 실험 설계는 체중 부하를 적용하고 방출하여 정확한 폐색과 왼쪽 간장 트라이 어드의 reperfusion 수 있습니다.
그림 2. 알라닌 (ALT)와 aspartate (대서양 표준시) 생쥐의 아미노 전이 효소에 따라 달라질 간 국소 빈혈 시간의 영향. 일부 포털 트라이 어드의 국소 빈혈은 지시 (- 60 분 국소 빈혈 0)로 유도되었다. reperfusion의 2 시간 후, ALT ()와 대서양 표준시 (B)가 측정되었다. 7 생쥐 / 그룹 - 결과가 수단 ± SE 6으로 표현됩니다. * P 0 분 국소 빈혈 (가짜 제어)에 비해 <0.05.
Discussion
현재 연구는 왼쪽 간장 포털 트라이 어드의 폐색에 대한 교수형 - 무게 시스템을 사용하여 murine 모델에서 국소 빈혈을 수행하는 방법을 설명합니다. 그것 배우는 쉬운 방법이지만 다음과 같은 함정은 고려되어야한다. 처음에 아주 흔한 실수는 포털 깡패와 대정 맥을 포함하고 깊은 스티치입니다. 호흡과 심장 박동이 증가 저항 및 생쥐의 초기 사망의 결과로 심장에 혈액을 반환의 감소로 인해 15 분 내에 진정됩니다. 대정 맥의를 포함을 방지하는 가장 좋은 방법은 집게로 바로 엽 (叶)을 누른 스티치 전에 대정 맥을 집중하는 것입니다. 또 다른 중요한 문제는 가중치도 오른쪽 엽 (叶)으로 혈액의 흐름을 중지 왼쪽 및 오른쪽 포털 시범 서비스에 너무 많은 스트레스를 초래할 수있는 무거운에없는 것입니다. 따라서 Eppendorf 튜브에있는 물의 양은 마우스 무게와 s에 조정되어야합니다uture 보유자는 스티치 위치에서 distally 배치해야합니다. 반대편에서 가중치가 낮은 혈압에있는 경우는 완전히 중지되지 않습니다. 두 실수는 쉽게 각각 중간과 왼쪽 엽 (叶)의 오른쪽 귓불이나 부족한 색상 변화의 창백한에 추가 색상의 변화가 감지된다. 따라서 가중치를 적용 따라 간장 색 변화는 10 분마다 제어되어야합니다. 또 다른 일반적인 수술 합병증은 바늘로 간 부상이다. 따라서 오른쪽 엽 (叶)은 바늘 끝이 쉽게 볼 수와 바늘 홀더로 찍은 수 있도록 개성이 집게로 잡고해야합니다. 처음에 이러한 함정을 고려하는 경우에는 간장 국소 빈혈에 대한 보내야-체중 시스템은 포털 트라이 어드의 클램핑과 관련된 간 손상의 변화를 최소화하여 국소 빈혈에 의한 높은 재현성 부상을 제공합니다. 교수형 - 무게 시스템을 사용하여 포털 깡패는 단지 전체에 걸쳐 한번에 조작할 수 있습니다수술은 간장 엽 (叶)에 훨씬 적은 피해를 입었습니다. 또한, 아무런 간장이나 장내 혼잡이 기술로 발생하지 않습니다. 더 많은 조직 외상, 특히 허혈성 preconditioning 동안 같은 여러 국소 빈혈 사이클 동안 클램프의 reapplication으로, 선박 클램프를 제거하고 교체에 의해 발생합니다. 클램프의 reapplication에 의한 간 엽 (叶)의 조작에 의한 조직 손상을 방지하면서, 우리의 관찰에 의하면, 간 조직에서 원격 위치에 가중치를 어슬렁의 사용은 안정적인 폐색의 장점을 제공합니다. 함께 찍은, 현재의 연구는 클램핑과 관련된 다양성과 한계를 최소화, 국소 빈혈 동안 포털 깡패 폐색에 대한 보내야-체중 시스템의 가능성을 제공합니다. 따라서이 기법은 간장 국소 빈혈을 공부 고려해 다른 수사에 대한 관심 있을겁니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
현재의 연구는 미국 국립 보건 연구소 기금의 R01-HL092188, R01-DK083385 및 R01HL098294, 그리고 아나스타샤 교육 및 연구 재단에 의해 지원되었다하면 (FAER) HKE 및 DFG (독일 Forschungsgemeinschaft) 연구 원정대 (에게 학자금 GR2121/1- 1) AG로 미국 심장 협회 그랜트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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References
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