استخدام نظام اعدام الوزن لالإسكيمية الكبد في الفئران

Summary

أنشأنا نموذجا رواية الفئران لنظام الوزن شنقا لبوابة ثالوث انسداد. قد يكون هذا الأسلوب مفيدا لإجراء تحقيقات في المستقبل من نقص التروية في نماذج الفئران كبدي.

Abstract

يمكن إصابة الكبد الحاد بسبب نقص التروية تحدث خلال الإجراءات السريرية عدة مثل زرع الكبد، والكبد استئصال ورم أو إصلاح الصدمة ويمكن أن يؤدي إلى فشل الكبد التي لديها ارتفاع معدل الوفيات ^1-2. وأصبحت دراسات الفئران ولذلك من نقص تروية الكبد حقل مهم للبحث عن طريق توفير الفرصة للاستفادة من دراسات الدوائية والوراثية ^3-9. على وجه التحديد، والفئران مشروط مع حذف أنسجة معينة من الجين (لجنة المساواة العرقية، flox النظام) تقديم نظرة ثاقبة لدور البروتينات في أنسجة معينة ^10-13. بسبب صعوبة التقنية المرتبطة لقط يدويا ثالوث بوابة في الفئران، وأجرينا تقييم منهجي باستخدام نظام اعدام الوزن عن انسداد ثالوث البوابة التي وصفت من قبل ^3. باستخدام نظام اعدام الوزن نضع الخيط حول الفرع الأيسر من ثالوث المدخل دون أن تسبب أي ضرر للفصوص الكبد، منذ أيضايمكن خيرة المشابك متاح يسبب تلف الأنسجة الكبدية بسبب موقع قريب من أنسجة الكبد في الأوعية. علاوة على ذلك، لا يزال perfused فرع حق ثالوث كبدي وبالتالي لا يحدث احتقان في الامعاء مع هذه التقنية كما تدفق الدم الى فصوص الكبد هو الحفاظ على حق. وعلاوة على ذلك، يتم التلاعب بها سوى مرة واحدة طوال ثالوث بوابة الإجراء الجراحي بأكمله. ونتيجة لذلك، مثل الإجراءات السابقة للتكييف، مع أوقات قصيرة من نقص التروية وضخه، لا يمكن أن يؤديها بسهولة. وكشف تقييم منهجي لهذا النموذج عن طريق أداء نقص التروية وأوقات مختلفة ضخه ارتباط وثيق من الوقت الإسكيمية كبدي مع تلف الكبد إذا ما قيست ألانين (البديل) واسبارتاتي (است) مستويات المصل الألانين ^3،9. أخذت معا، وهذه الدراسات تؤكد استنساخه للغاية اصابة الكبد عند استخدام نظام اعدام الوزن لنقص تروية الكبد وضخه على فترات متقطعة. وبالتالي، قد يكون هذا الأسلوب مفيدا لمصلحة المحققين الآخرينإد في دراسات الإسكيمية الكبد في الفئران. ولذلك فإن الفيديو كليب يوفر مفصلة خطوة بخطوة وصف لهذه التقنية.

Protocol

يجب أن يتم تنفيذ الملاحظات العامة. جميع العمليات تحت المجهر تستقيم تشريح (لايكا) وباستخدام مخثار الجراحية. وينبغي أن تكون مطابقة للفئران في المجموعتين التجريبية والشام في العمر والوزن لضمان إمكانية المقارنة بين النتائج. وينبغي أن درجة الحرارة وضغط الدم والتخدير وسائل الإدارة أن تكون مستقرة ورصدها خلال التجربة بأكملها.

1. التخدير والجراحة

1. وينبغي أن C57BL / 6 الفئران يكون ضمن الفئة العمرية من 10 إلى 16 أسبوعا، وأنها ينبغي أن تكون مطابقة بين الجنسين في كل مجموعة على حدة.
2. تخدير الفئران مع الصوديوم بنتوباربيتال (70 من وزن الجسم ملغم / كغم للملكية الفكرية) والحفاظ على التخدير مع تقريبا. 10 مغ / كغ / ساعة بنتوباربيتال الصوديوم. ويمكن زيادة الجرعة يقلل بشكل ملحوظ من ضغط الدم، وبالتالي يمكن أن يغير النتائج.
3. الفئران مكان على طاولة درجة الحرارة التي تسيطر عليها حامية (RT، Effenberg، ميونيخ، ألمانيا) مع التحقيق الذي تجريه ميزان الحرارة المستقيمي تعلق على ردود الفعل الحراريللحفاظ على وحدة تحكم درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية.
4. الفئران مكان في موقف مستلق على طاولة الجراحة، مع الأطراف العليا والسفلى التي تعلق على الطاولة مع شريط قابل للنقل.
5. في حالة البقاء على قيد الحياة من التجارب مطلوبة تقنيات التعقيم المناسبة بما في ذلك لقطة من الشعر، وتطهير الجلد مع iodophors (على سبيل المثال Betadine)، ومناولة معقم للصكوك مشبع، واستخدام الأقنعة والقفازات المعقمة 1 للجراح.

2. بوابة ثالوث الإنسداد

1. تغطي منطقة شق مع الزيوت المعدنية لمنع استنشاق شعر الماوس عن طريق قطع في الجلد وبالتالي منع خطر الحساسية شعر الفأر. اداء خط الوسط والبطن شق من ألبا الخط حتى نهاية العلوي بحيث يمكن بسهولة كشف الكبد. إذا كان ذلك ممكنا إجراء شق مع القطب التخثر (Erbe، ICC50، توبينجن، ألمانيا) لمنع النزيف.
2. وضع جدول للتدفئة مع الماوس في وضع يمكنها من ان الذيل هو direcتيد للجراح. هذا الموقف يوفر لك أفضل الإعداد لتوطين ثالوث ووضع خياطة.
3. تهجير الأمعاء على الجانب الأيمن عن طريق استخدام معلومات سرية قطن مبللة مسحة لفضح ثالوث المدخل.
4. تحول قليلا الفص المتوسط ​​واليسار نحو الحجاب الحاجز والفص الأيمن نحو الأمعاء. والتي تعطيك رؤية واضحة للثالوث بوابة أعلاه والتشعب من حق فصوص متوسط ​​/ يسار،.
5. فحص دقيق لثالوث بوابة وعقد الفص الأيمن برفق مع ملقط لطيف. والتي تعطيك وجهة نظر لطيفة على ثالوث بوابة اليسار.
6. مرة عيانا مكان الإبرة مع خياطة (7/0 خاط النايلون؛ Ethicon، Norderstedt، ألمانيا) عن طريق حامل الإبرة تحت ثالوث بوابة اليسار، بما في ذلك الشريان الكبدي، الوريد الكبدي، والقناة الصفراوية من اليسار إلى اليمين من الفأرة.
7. وغرزة يجب أن يكون بشكل وثيق في إطار الثالوث. ويمكن لأعمق غرزة تجرح فاكا الوريد السفلي الذي يقع تحتثالوث. ولذلك فإن عقد فصوص الكبد حق إلى أسفل مع ملقط لتحديد الوريد الأجوف قبل وضع غرزة.
8. أخذ رأس الإبرة على الجانب الأيمن مع ملقط وتسحبه بلطف من المنطقة الكبد دون إصابة الكبد.
9. نعلق على كل نهاية خياطة أنبوب إيبندورف (ما يقرب من 3 غرام، مملوء بالماء) ووضع كل من خاط تنتهي خلال حملة خياطة. وضع صاحب خاط بشكل أقصى للغرزة حتى يتسنى للخياطة لا تتداخل مع ثالوث الحق.
10. من خلال تطبيق الأوزان سوف يكون ثالوث المغطي على الفور، مما تسبب في انقطاع امدادات الدم الى الفص الأيسر وسيطة من الكبد. ويمكن انسداد ناجحة أكدت بسهولة عن طريق التفتيش البصري من ابيضاض شاحب من الفصوص الدماغية. في المقابل، تغير لون يختفي على الفور عندما يتم الافراج عن الأوزان المتدلية من أعمدة وإشباعها في الكبد. هذا نقص تروية الكبد الجزئي نموذج يتجنب الازدحام المساريقي من خلال الحفاظ على blooد تدفق إلى فصوص الكبد حق.
11. استبدال الأمعاء إلى تجويف البطن. الحفاظ على الكبد والأمعاء دافئ مع مسحة غارقة الرطب مع الماء عند 37.0 درجة مئوية. وبالإضافة إلى ذلك للحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة تغطي الفئران مع ورق تغليف المواد الغذائية متوفرة تجاريا بعد الانتهاء من عملية جراحية.
12. أداء نقص التروية كما هو مطلوب في بروتوكول تجريبي. بعد الافراج عن نقص التروية زمنية محددة والأوزان وضخه من فصوص الكبد وسيطة واليسار تبدأ على الفور. هذا الأسلوب يسمح المنتجة الإسكيمية عكسها في الفئران. إذا كان سيتم تنفيذ لم مرات الإسكيمية مزيد من إزالة بعناية خياطة.
13. إضافة حوالي 400 كلوريد الصوديوم ميكرولتر داخل تجويف البطن قبل 15 دقيقة ومباشرة بعد ضخه. الاستمرار في استبدال السوائل كل 30 دقيقة في مبلغ قدره 100 ميكروليتر لتعويض الفاقد من السوائل خلال فترة ضخه.
14. للتجارب بقاء يتم إغلاق الجروح باستخدام خياطة مستمرة في الجدار العضلي وواي جلدال 1 خياطة 4/0.

3. تغييرات في الإرواء الكبد

ويوصى المعلمات نتيجة التالية لتحديد الكبد الإسكيمية اصابة كبدي التالية:

تحديد انزيمات الكبد (مثل ALT، AST) والكبد والأنسجة (H & E تلطيخ) التالية الإسكيمية الكبد وضخه ^3،9.

الشكل 1 نموذج لنظام اعدام الوزن لنقص تروية الكبد: وقد تم إنشاء نظام الوزن شنقا للحث على نقص تروية الكبد من الفص الأيسر ومتوسط ^​​3. (أ) تم فصل بلطف ولذلك الفص المذنبة، والحق من الفص الأيسر. وكان الفص الأيمن ثم تحول قليلا لعرضها بوضوح ثالوث بوابة أعلاه والتشعب من الفصوص، والحق وسيطة واليسار. وضعت وخاط النايلون 8،0 تحت ثالوث كبدي اليسار. (ب) في نهاية كل غرزة على وزن صغير (3 ز إيبندورف تووعلقت بيز مملوء بالماء) وتطبيقها. الإسكيمية كبدي مرئيا عن تغيير لون من الفص الأيسر وسيطة من اللون الأحمر إلى شاحب. هذا التصميم التجريبي يسمح انسداد دقيقة وضخه من ثالوث كبدي اليسار عن طريق تطبيق والافراج عن حمولة الوزن.

الشكل 2. تأثير مختلف الأوقات الإسكيمية الكبد في ألانين (البديل) واسبارتاتي (است) الألانين في الفئران. وكان المستحث جزئي الإسكيمية ثالوث بوابة على النحو المبين (0-60 الإسكيمية دقيقة). بعد 2 ساعة من ضخه، تم قياس ALT (أ) و AST (B). يتم التعبير عن النتائج على النحو SE ± سائل 6-7 الفئران / مجموعة. * P <0.05 مقارنة مع نقص التروية دقيقة 0 (الشام السيطرة).

Discussion

هذه الدراسة وصفا لأسلوب أداء الإسكيمية في نموذج الفئران باستخدام نظام اعدام الوزن عن انسداد ثالوث كبدي بوابة اليسار. وينبغي على الرغم من أنها وسيلة سهلة لتعلم أن تؤخذ في المزالق التالية في الاعتبار. وهناك خطأ شائع جدا في البداية عبارة عن غرزة العميق الذي يتضمن الثالوث بوابة والوريد الأجوف. فإن معدل التنفس والقلب وتبطئ في غضون 15 دقيقة نظرا لمقاومة زيادة والنقصان في عودة الدم الى القلب مما يؤدي إلى الموت في وقت مبكر من الفئران. أفضل وسيلة لمنع وبما فيها من الوريد الأجوف هو في توطين الوريد الأجوف قبل غرزة من خلال عقد الفصوص حق إلى أسفل مع الملقط. مسألة هامة أخرى هي أن الأوزان ليست لالثقيلة التي يمكن أن تؤدي إلى الكثير من الضغط على المحاكمة بوابة اليسار واليمين الذي توقف أيضا تدفق الدم الى فصوص حق. ولذلك ينبغي أن يتم ضبط كمية من الماء في قوارير إيبندورف لوزن الماوس وقيجب أن يوضع أصحاب uture بشكل أقصى من موقع غرزة. على العكس إذا لم يتم الأوزان هي انخفاض ضغط الدم توقفت تماما. كل الأخطاء يمكن اكتشافها بسهولة من قبل تغير لون إضافي إلى شاحب من الفص الأيمن أو عدم كفاية تغير لونها من الفص المتوسط ​​واليسار، على التوالي. ولذلك ينبغي أن تسيطر على تغير لون الكبد بعد تطبيق الأوزان كل 10 دقائق. تعقيد آخر هو مشترك الجراحية مما اسفر عن اصابة الكبد مع الإبرة. ولذلك ينبغي عقد الفصوص حق إلى أسفل مع ملقط لطيف بحيث يمكن لرأس الإبرة ينظر اليه بسهولة، والتي اتخذت مع صاحب إبرة. إذا ما اتخذت هذه المزالق في البداية في الاعتبار نظام اعدام الوزن عن نقص التروية كبدي يوفر اصابة استنساخه للغاية نظرا لنقص التروية عن طريق التقليل من تقلب تلف الكبد المرتبطة لقط من ثالوث المدخل. باستخدام نظام اعدام الوزن، ويتم التلاعب بها فقط ثالوث بوابة مرة في جميع أنحاء كاملإجراء العمليات الجراحية، مما تسبب في أضرار أقل إلى حد كبير في فصوص الكبد. وبالإضافة إلى ذلك، لا احتقان الكبد أو الأمعاء يحدث مع هذه التقنية. أكثر صدمة الأنسجة يحدث عن طريق إزالة واستبدال المشابك السفينة، وخصوصا مع إعادة استخدام المشبك خلال دورات متعددة مثل نقص التروية الدماغية خلال شروط مسبقة. استخدام الأوزان المعلقة التي هي في مكان بعيد من أنسجة الكبد، وفقا لملاحظاتنا، ويوفر ميزة من انسداد يمكن الاعتماد عليها في حين منع الصدمة الأنسجة بسبب التلاعب في فصوص الكبد عن طريق إعادة استخدام المشبك. أخذت معا، فإن الدراسة الحالية تقدم دراسة الجدوى للنظام اعدام الوزن لبوابة ثالوث انسداد خلال نقص التروية، والتقليل من التفاوت والقيود المرتبطة تحامل. وبالتالي قد تكون هذه التقنية ذات الاهتمام بالنسبة للمحققين آخرين في دراسة نقص التروية كبدي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4 mg/mL in saline
Suture, Prolene 8.0	Ethicon, USA	M8739	reusable
dissecting microscope	Leica	n/a	consider generous working distance
Heating Table	Rt, Effenberger, Germany	n/a	only and single provider
Surgical instruments	WPI, Dumont		Forceps, needle holder
Coagulator	Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany	n/a	Different providers of coagulators
Table 1. Specific reagents and equipment.