Summary
Nous avons établi un modèle murin roman d'un système de poids suspendu pour le portail triade d'occlusion. Cette technique peut être utile pour des enquêtes futures de l'ischémie dans les modèles murins hépatiques.
Abstract
Atteinte hépatique aiguë due à une ischémie peut se produire au cours de plusieurs procédures cliniques de transplantation du foie par exemple, résection de la tumeur hépatique ou la réparation des traumatismes et peut entraîner une insuffisance hépatique qui a un taux élevé de mortalité 1-2. Par conséquent études murin d'ischémie hépatique sont devenus un important domaine de recherche en offrant la possibilité d'utiliser les études pharmacologiques et génétiques 3-9. Plus précisément, les souris conditionnelles avec suppression du tissu spécifique d'un gène (CRE, flox système) fournir des indications sur le rôle des protéines dans des tissus particuliers 10-13. En raison de la difficulté technique associée à la main de serrage de la triade portale chez la souris, nous avons effectué une évaluation systématique à l'aide d'un système de pendaison de poids pour le portail triade d'occlusion qui a été décrit précédemment 3. En utilisant un système de suspension de poids nous plaçons un fil de suture autour de la branche gauche de la triade portale sans causer de dommages aux lobes hépatiques, depuis aussi lemeilleurs colliers disponibles peuvent endommager les tissus hépatiques en raison de la proximité des tissus du foie aux navires. En outre, la branche droite de la triade hépatique est encore perfusé donc pas de congestion intestinale se produit avec cette technique que le flux sanguin vers les lobes hépatiques droit est préservé. En outre, la triade portale est uniquement manipulé une fois pendant toute la procédure chirurgicale. En conséquence, les procédures comme le pré-conditionnement, avec des temps courts de l'ischémie et la reperfusion, peut être facilement réalisée. L'évaluation systématique de ce modèle en effectuant une ischémie reperfusion fois différent et a révélé une corrélation étroite entre le temps d'ischémie hépatique avec des dommages au foie, telle que mesurée par l'alanine (ALT) et aspartate (AST) aminotransférases sériques 3,9. Pris ensemble, ces études confirment une lésion hépatique hautement reproductible lors de l'utilisation du système de suspension de poids de l'ischémie reperfusion hépatique et intermittente. Ainsi, cette technique pourrait être utile pour l'intérêt d'autres chercheursed dans les études d'ischémie du foie chez la souris. Par conséquent, le clip vidéo fournit une description étape par étape la description de cette technique.
Protocol
Remarques générales. Toutes les opérations doivent être effectuées en vertu d'un microscope droit de dissection (Leica) et en utilisant un coagulateur chirurgical. Les souris dans les groupes expérimentaux et imposture doit être adapté à l'âge et le poids pour assurer la comparabilité des résultats. L'administration de la température, la pression artérielle, l'anesthésie et le liquide doit être stable et surveillés pendant toute l'expérience.
1. Anesthésie et la chirurgie
- Souris C57BL / 6 devrait se situer dans une tranche d'âge des 10 à 16 semaines et ils devraient être entre les sexes appariés dans les groupes respectifs.
- Anesthésier souris avec du pentobarbital sodique (70 mg / kg de poids corporel ip) et maintenir une anesthésie avec env. 10 mg / kg / h du pentobarbital de sodium. Un surdosage peut réduire considérablement la pression artérielle et peut donc modifier les résultats.
- Souris Placer sur une table chauffée à température contrôlée (RT, Effenberg, Munich, Allemagne) avec une sonde thermomètre rectal attaché à une rétroaction thermiqueContrôleur pour maintenir la température du corps à 37 ° C.
- Souris Placer dans une position en décubitus dorsal sur la table d'opération, avec les extrémités supérieures et inférieures attachées à la table avec du ruban adhésif amovible.
- Dans le cas d'expériences de survie appropriés les techniques d'asepsie, y compris écrêtage des cheveux, la désinfection de la peau avec iodophores (Bétadine par exemple), la manipulation stérile des instruments autoclavés, et en utilisant des masques d'un des gants stériles pour le chirurgien sont nécessaires.
2. Portail Triade d'occlusion
- Couvrir la zone d'incision avec de l'huile minérale pour éviter d'inhaler des cheveux de la souris en coupant la peau et ainsi prévenir les risques d'allergies cheveux de souris. Effectuer une laparotomie médiane et l'incision de la ligne blanche à l'extrémité supérieure de telle sorte que vous pouvez facilement exposer le foie. Si possible effectuer l'incision avec une électrode de coagulation (Erbe, ICC50, Tübingen, Allemagne) pour prévenir les saignements.
- Placez la table de chauffage avec la souris dans une position que la queue est direcTed pour le chirurgien. Cette position vous fournit le meilleur réglage pour localiser la triade et de placer le fil de suture.
- Déplacer l'intestin sur le côté droit en utilisant un coton-tige humide pointe pour exposer la triade portale.
- Décaler légèrement l'lobe médian et gauche vers la membrane et le lobe droit vers l'intestin. Cela vous donnera une vision claire de la triade portail au-dessus de la bifurcation de droite, médiane / gauche lobes.
- Inspectez soigneusement la triade portale et maintenez le lobe droit doucement avec une pince fades. Cela vous donnera une belle vue sur la triade portale gauche.
- Une fois identifié visuellement lieu de l'aiguille avec le fil de suture (suture de nylon 7/0; Ethicon, Norderstedt, Allemagne) via un porte-aiguille sous la gauche triade portale, y compris l'artère hépatique, veine sus-hépatique, et la voie biliaire partir de la gauche vers la droite de la souris.
- Le point doit être étroitement dans le cadre de la triade. Un profond point peut nuire à la cave vaca inférieure qui se trouve sousla triade. Par conséquent maintenir les lobes du foie droit vers le bas avec la pince à identifier la veine cave avant de placer le point.
- Prenez la pointe de l'aiguille sur le côté droit avec une pince et tirez-le doucement hors de la région du foie, sans blesser le foie.
- Attacher à chaque extrémité de la suture un tube Eppendorf (environ 3 g, rempli d'eau) et placer deux extrémités de suture sur porteurs de suture. Placer le porte-suture distalement de la maille de sorte que le fil de suture n'interfère pas avec la triade droite.
- En appliquant les poids de la triade sera immédiatement occlus, causant l'interruption de l'approvisionnement en sang vers les lobes gauche et médiane du foie. Occlusion réussie peut être facilement confirmé par une inspection visuelle de blanchiment pâle des lobes ischémiques. En revanche, le changement de couleur disparaît immédiatement lorsque les poids suspendus sont libérés à partir des pôles et le foie est reperfusé. Ce modèle d'ischémie hépatique partielle évite la congestion mésentérique en préservant bloodébit d pour les lobes du foie droit.
- Remplacer l'intestin dans la cavité abdominale. Gardez le foie et l'intestin chaude avec un coton-tige humide imbibé d'eau à 37,0 ° C. En plus de maintenir la température corporelle stable couvrir les souris avec une pellicule plastique alimentaire disponibles dans le commerce après avoir terminé la chirurgie.
- Effectuer une ischémie comme requis par le protocole expérimental. Après un communiqué le temps d'ischémie défini les poids et la reperfusion des lobes du foie médian et gauche va commencer immédiatement. Cette technique permet de produire une ischémie réversible chez les souris. Si aucun temps d'ischémie ne sera effectué retirez soigneusement la suture.
- Ajouter environ 400 pi de chlorure de sodium dans la cavité abdominale de 15 minutes avant et directement après la reperfusion. Continuer à remplacer toutes les 30 minutes de fluide en une quantité de 100 pl pour compenser la perte de fluide pendant le temps de reperfusion.
- Pour les expériences de survie de la plaie opératoire est fermé à l'aide de suture continue de la paroi musculaire et de la peau wie un fil de suture 4/0.
3. Modification de la perfusion du foie
Les paramètres de résultats suivants sont recommandés afin de déterminer une lésion hépatique hépatique ischémie suivant:
Déterminer des enzymes hépatiques (par exemple ALT, AST) et l'histologie hépatique (coloration H & E) ischémie hépatique qui suit et la reperfusion 3,9.
Figure 1 Modèle d'un système de pendaison-poids de l'ischémie du foie:. Un système de poids suspendu a été mis en place pour induire une ischémie du foie du lobe gauche et médiane 3. (A) Par conséquent, le lobe caudé et le droit ont été doucement séparé du lobe gauche. Le lobe droit était alors légèrement décalée de visualiser clairement la triade portail au-dessus de la bifurcation de droite, lobes médian et gauche. Une suture en nylon 8,0 a été placé sous la triade hépatique gauche. (B) A la fin de chaque suture un petit poids (3 g Eppendorf tubes remplis avec de l'eau) a été fixé et appliqué. Ischémie hépatique est visible par un changement de couleur du lobe gauche et médian du rouge au pâle. Cette conception expérimentale permet l'occlusion et la reperfusion précise de la triade hépatique gauche en appliquant et en relâchant le poids de la charge.
Figure 2. Effet de différents temps de l'ischémie du foie sur l'alanine (ALT) et aspartate (AST) aminotransférase chez la souris. Partielle portail triade ischémie a été induite comme indiqué (0 - 60 minutes d'ischémie). Après 2 heures de reperfusion, ALT (A) et AST (B) ont été mesurés. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SE de 6 à 7 souris par groupe. * P <0,05, comparativement à 0 minutes d'ischémie (simulacre de contrôle).
Discussion
La présente étude décrit une technique d'effectuer une ischémie dans un modèle murin en utilisant un système de suspension de poids pour l'occlusion de la triade portale hépatique gauche. Bien que c'est une méthode facile à apprendre les pièges suivants devraient être pris en compte. Une erreur très commune dans le début est un point de profond qui comprend le portail triade et la veine cave. Le rythme de la respiration et le cœur va ralentir dans les 15 minutes en raison de l'augmentation de la résistance et la diminution de retour du sang vers le cœur entraînant une mort précoce des souris. La meilleure façon de prévenir l', y compris de la veine cave est de localiser la veine cave avant le point en tenant les lobes droit vers le bas avec une pince. Une autre question importante est que les poids lourds ne sont pas à ce qui peut entraîner trop de stress sur le procès portail de gauche et de droite qui s'arrête aussi le flux sanguin vers les lobes droit. Par conséquent, la quantité d'eau dans les flacons de Eppendorf doit être ajustée au poids de la souris et le sporteurs AVENIR doit être placé de manière distale à partir de l'emplacement de point. A l'inverse, si les poids sont à une pression artérielle basse n'est pas complètement arrêté. Les deux erreurs sont facilement détectables par un changement de couleur supplémentaire à pâle du lobe droit ou changement de couleur insuffisante des lobes médians et à gauche, respectivement. Par conséquent, le changement de couleur hépatique après application des pondérations doivent être contrôlés toutes les 10 minutes. Une autre complication chirurgicale courante est le blessant du foie à l'aiguille. Par conséquent, les lobes droit devrait être tenu vers le bas avec une pince fades de sorte que la pointe de l'aiguille peut être facilement vu et pris avec un porte-aiguille. Si ces pièges dans le début sont pris en compte le système de suspension de poids pour une ischémie hépatique fournit une lésion hautement reproductible due à une ischémie par minimisation de la variabilité de lésions hépatiques associé à serrage de l'espace porte. En utilisant un système de suspension de poids, la triade portale est uniquement manipulé une fois pendant toute laintervention chirurgicale, ce qui provoque beaucoup moins de dégâts au niveau des lobes hépatiques. En outre, pas de congestion hépatique ou intestinale se produit avec cette technique. Plus un traumatisme tissulaire se produit par suppression et remplacement des navires pinces, surtout avec une nouvelle application de la pince pendant les cycles de l'ischémie pendant plusieurs comme un préconditionnement ischémique. L'utilisation de la pendaison de poids qui sont dans un endroit éloigné du tissu hépatique, d'après nos observations, offre l'avantage de l'occlusion fiable tout en évitant le traumatisme tissulaire due à la manipulation des lobes du foie par réapplication d'une pince. Pris dans leur ensemble, la présente étude fournit la faisabilité du système de suspension de poids pour le portail triade d'occlusion pendant l'ischémie, ce qui minimise la variabilité et les limites associées à de serrage. Ainsi, cette technique pourrait être d'intérêt pour les enquêteurs d'autres qui considèrent étudier l'ischémie hépatique.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les présentes études ont été soutenus par des instituts des États-Unis National de la Santé de subvention R01-HL092188, R01-DK083385 et R01HL098294, et la Fondation pour l'éducation anesthésie et de la Recherche (FAER) Subventions à HKE et un DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) de bourses de recherche (GR2121/1- 1) et l'American Heart Association à Grant AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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