Summary
Abbiamo stabilito un nuovo modello murino di un sistema di peso appeso per il portale triade occlusione. Questa tecnica può essere utile per future di ischemia in modelli murini epatiche.
Abstract
Danno epatico acuto dovuto a ischemia può verificarsi durante una serie di procedure cliniche di trapianto ad esempio il fegato, tumore resezione epatica o la riparazione del trauma e può portare a insufficienza epatica che ha un alto tasso di mortalità 1-2. Pertanto gli studi murini di ischemia epatica sono diventati un importante campo di ricerca, fornendo l'opportunità di utilizzare studi farmacologici e genetici 3-9. In particolare, i topi condizionali con delezione tessuto-specifica di un gene (CRE, flox sistema) fornire indicazioni sul ruolo delle proteine nei tessuti particolari 10-13. A causa delle difficoltà tecniche associate manualmente serraggio della triade portale in topi, abbiamo eseguito una valutazione sistematica utilizzando un pensile peso sistema di occlusione triade portale che è stato precedentemente descritto 3. Utilizzando un pensile peso del sistema mettiamo una sutura intorno al ramo sinistro della triade portale senza causare danni ai lobi epatici, dal momento che anche ilmigliori disponibili morsetti può causare danni ai tessuti epatica a causa della vicinanza del tessuto epatico ai vasi. Inoltre, il ramo di destra della triade epatica è ancora perfuso congestione intestinale quindi non si verifica con questa tecnica, come il flusso di sangue ai lobi epatici destro è conservato. Inoltre, la terna portale viene manipolato sola volta durante tutta la procedura chirurgica. Come risultato, come procedure di pre-condizionamento, con brevi tempi di ischemia e riperfusione, può essere eseguita facilmente. Valutazione sistematica di questo modello eseguendo diversi e tempi di ischemia riperfusione ha rivelato una stretta correlazione di tempo ischemia epatica con danni al fegato come misurato da alanina (ALT) e aspartato (AST), i livelli sierici di transaminasi 3,9. Presi insieme, questi studi confermano danno epatico altamente riproducibili quando si utilizza il pensile peso sistema di ischemia e di riperfusione epatica intermittente. Così, questa tecnica può essere utile per altre interesse investigatorinegli studi ed ischemia del fegato nei topi. Pertanto il video clip fornisce una descrizione dettagliata della descrizione dettagliata di questa tecnica.
Protocol
Osservazioni generali. Tutte le operazioni devono essere eseguite con un microscopio da dissezione montante (Leica) e utilizzando un coagulatore chirurgico. I topi nei gruppi sperimentali e sham deve essere trovato al dell'età e del peso per garantire la comparabilità dei risultati. Amministrazione temperatura, pressione arteriosa, anestesia e fluido deve essere stabile e monitorato durante l'intero esperimento.
1. Anestesia e Chirurgia
- Topi C57BL / 6 dovrebbe essere all'interno di un range di età da 10 a 16 settimane e dovrebbero essere in genere abbinato nei rispettivi gruppi.
- Anestetizzare topi con sodio pentobarbital (70 mg / kg ip peso corporeo) e mantenere l'anestesia con ca. 10 mg / kg / h di sodio pentobarbital. Sovradosaggio può ridurre significativamente la pressione sanguigna e quindi in grado di alterare i risultati.
- Topi, posizionarli su una temperatura controllata tabella riscaldata (RT, Effenberg, Monaco di Baviera, Germania) con una sonda del termometro rettale collegato a un feedback termicoregolatore per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C.
- Topi posto in posizione supina sul tavolo operatorio, con le estremità superiori e inferiori attaccate al tavolo con del nastro adesivo rimovibile.
- In caso di esperimenti di sopravvivenza corrette tecniche asettiche tra cui ritaglio di capelli, la disinfezione della pelle con iodofori (es. Betadine), gestione sterile degli strumenti autoclavati, e utilizzando le maschere a guanti sterili per il chirurgo sono obbligatori.
2. Portal Triad occlusione
- Coprire l'area incisione con olio minerale per evitare l'inalazione di capelli mouse tagliare la pelle e quindi prevenire il rischio di allergie capelli del mouse. Eseguire laparotomia linea mediana e l'incisione della linea alba fino alla fine superiore in modo che si può facilmente esporre il fegato. Se possibile eseguire l'incisione con un elettrodo coagulazione (Erbe, ICC50, Tuebingen, Germania) per prevenire le emorragie.
- Posizionare il tavolo di riscaldamento con il mouse in una posizione che la coda è direttaTed al chirurgo. Tale posizione vi offre la migliore impostazione per localizzare la triade e di collocare la sutura.
- Spostare l'intestino sul lato destro utilizzando un tampone umido punta di cotone per esporre la terna portale.
- Spostare leggermente il lobo mediano e sinistro verso il diaframma e il lobo destra verso l'intestino. Questo vi darà una visione chiara della triade portale sopra la biforcazione di destra, mediana / sinistra lobi.
- Ispezionare con cura la triade portale e tenere premuto il lobo destro dolcemente con una pinza blande. Questo vi darà una bella vista sulla triade portale di sinistra.
- Una volta identificato visivamente posto l'ago con la sutura (nylon 7/0 sutura, Ethicon, Norderstedt, Germania) tramite un supporto dell'ago sotto la sinistra portale triade, compreso l'arteria epatica, vena epatica, e dotto biliare da sinistra a destra del mouse.
- Il punto deve essere a stretto contatto con la triade. Un punto più profondo possono ferire l'vena vaca inferiore che si trova sottola triade. Pertanto tenere i lobi del fegato destro verso il basso con le pinze per identificare la vena cava prima di mettere il punto.
- Prendere la punta dell'ago sul lato destro con una pinza e tirare delicatamente fuori della zona del fegato senza danneggiare il fegato.
- Attaccare a ciascuna estremità della sutura un tubo Eppendorf (circa 3 g, riempito con acqua) e posizionare sia sutura estremità su supporti di sutura. Posizionare il titolare sutura distale del punto in modo che la sutura non interferisce con la terna destra.
- Applicando i pesi della triade sarà immediatamente occlusa, causando l'interruzione di fornitura di sangue ai lobi sinistra e mediana del fegato. Occlusione di successo può essere facilmente confermata mediante ispezione visiva delle sbiancamento pallida dei lobi ischemiche. Al contrario, il cambiamento di colore scompare immediatamente quando i pesi sospesi vengono rilasciati dai poli e il fegato è riperfuso. Questo modello di parziale ischemia mesenterica evitare la congestione epatica, preservando Blooil flusso d per i lobi del fegato giuste.
- Sostituire l'intestino nella cavità addominale. Tenere il fegato e intestino caldo con un tampone umido imbevuto di acqua a 37,0 ° C. Oltre a mantenere la temperatura corporea stabile coprire i topi con l'involucro di cibo disponibile in commercio dopo aver terminato l'intervento chirurgico.
- Eseguire ischemia come previsto da protocollo sperimentale. Dopo un comunicato ischemia determinato periodo di tempo i pesi e la riperfusione dei lobi epatici mediani e di sinistra inizierà immediatamente. Questa tecnica permette di produrre ischemia reversibile nei topi. Se non i tempi di ischemia verranno condotte ulteriori rimuovere con attenzione la sutura.
- Aggiungere circa 400 microlitri di cloruro di sodio nella cavità addominale 15 minuti prima e direttamente dopo la riperfusione. Continuare a sostituire fluido ogni 30 minuti in una quantità di 100 pl per compensare la perdita di fluido durante il tempo riperfusione.
- Per gli esperimenti di sopravvivenza della ferita chirurgica viene chiusa mediante sutura continua della parete muscolare e la pelle wi° a 4/0 sutura.
3. Variazioni perfusione epatica
I parametri seguenti risultati si consiglia di determinare danni al fegato ischemia epatica seguente:
Determinare enzimi epatici (ad esempio ALT, AST) e istologia epatica (colorazione H & E) ischemia e riperfusione del fegato seguente 3,9.
Figura 1 Modello di un pensile peso del sistema per ischemia del fegato:. Un sistema di pesi sospensione è stato istituito per indurre ischemia del fegato del lobo sinistro e mediano 3. (A) Pertanto, il lobo caudato destro e sono stati leggermente separato dal lobo sinistro. Il lobo destro è stato poi leggermente spostata per visualizzare chiaramente la triade portale sopra la biforcazione di destra, lobi mediani e sinistra. Un 8,0 sutura in nylon è stata posta sotto la triade epatico sinistro. (B) Alla fine di ciascuna sutura un piccolo peso (3 g Eppendorf tubes pieni d'acqua) è stato attaccato e applicata. Ischemia epatica è visibile da un cambiamento di colore del lobo sinistro e mediano dal rosso pallido. Questo disegno sperimentale consente occlusione precisa e riperfusione della triade epatico sinistro applicando e rilasciando il carico peso.
Figura 2. Effetto di diversi tempi di ischemia epatica in alanina (ALT) e aspartato (AST) aminotransferasi nei topi. Parziale portale ischemia triade è stata indotta come indicato (0 - 60 ischemia min). Dopo 2 ore di riperfusione, ALT (A) e AST (B) sono stati misurati. I risultati sono espressi come media ± SE di 6 - 7 topi per gruppo. * P <0.05 rispetto allo 0 min ischemia (sham di controllo).
Discussion
Il presente studio descrive una tecnica di esecuzione ischemia in un modello murino utilizzando un pensile peso sistema di occlusione della triade sinistra epatica portale. Anche se è un modo semplice per imparare le insidie seguenti dovrebbero essere presi in considerazione. Un errore molto comune all'inizio è un punto profondo che comprende il portale triade e la vena cava. La frequenza respiratoria e cardiaca rallenterà entro 15 minuti a causa della maggiore resistenza e la diminuzione ritorno del sangue al cuore con conseguente morte prematura dei topi. Il modo migliore per prevenire l'compreso della vena cava è quello di localizzare la vena cava prima che il punto per tenere i lobi destro verso il basso con una pinza. Un altro aspetto importante è che i pesi non sono pesanti che possono provocare troppo stress sul processo portale sinistro e destro che si ferma anche il flusso di sangue ai lobi giuste. Pertanto la quantità di acqua nel flaconcini Eppendorf deve essere regolata al peso del mouse e la stitolari FUTURO deve essere posizionato distalmente dalla posizione del punto. Al contrario se i pesi sono a bassa pressione sanguigna non è completamente fermo. Entrambi gli errori sono facilmente riconoscibili da un cambiamento di colore aggiuntivo pallido del lobo destro o cambiamento di colore insufficiente dei lobi mediani e di sinistra, rispettivamente. Pertanto, il cambiamento di colore epatica dopo l'applicazione dei pesi dovrebbe essere controllato ogni 10 minuti. Un'altra complicazione comune chirurgica è il ferimento del fegato con l'ago. Pertanto i lobi diritto deve essere premuto con una pinza blande in modo che la punta dell'ago può essere facilmente visto e preso con un porta-aghi. Se queste trappole in principio sono prese in considerazione il pensile peso sistema di ischemia epatica fornisce una lesione altamente riproducibile a causa di ischemia riducendo al minimo la variabilità del danno epatico associato serraggio della triade portale. Utilizzando un sistema pensile peso, la terna portale viene manipolato sola volta durante l'interoprocedura chirurgica, causando danni molto meno ai lobi epatici. Inoltre, nessuna congestione epatica o intestinale si verifica con questa tecnica. Trauma dei tessuti più avviene rimuovendo e sostituendo i morsetti delle navi, in particolare con riapplicazione della pinza durante i cicli di ischemia più come durante precondizionamento ischemico. L'uso di appendere pesi che sono in una posizione remota dal tessuto epatico, secondo le nostre osservazioni, fornisce il vantaggio di occlusione affidabile evitando trauma tessuto dovuto alla manipolazione dei lobi epatica di reapplication di un morsetto. Considerati nel loro insieme, il presente studio fornisce fattibilità del pensile peso del sistema per il portale triade occlusione durante l'ischemia, riducendo al minimo la variabilità ei limiti associati a bloccaggio. Quindi questa tecnica potrebbe essere di interesse per altri ricercatori che considerano lo studio ischemia epatica.
Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Gli studi attuali sono stati sostenuti da United States National Institutes of Health-HL092188 concessione R01, R01-DK083385 e R01HL098294, e la Fondazione per l'educazione e la ricerca Anestesia (Faer) concede HKE e una (Deutsche Forschungsgemeinschaft) DFG Research Fellowship (GR2121/1- 1) e dell'American Heart Association Grant per AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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References
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005 (2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
