Summary
Vi etablerade en ny mus modell av en hängande vikt för portalen triad ocklusion. Denna teknik kan vara användbar för framtida undersökningar av ischemi i murina lever modeller.
Abstract
Akut leverskada till följd av ischemi kan uppstå under flera kliniska rutiner t.ex. lever transplantation, levertumör resektion eller trauma reparation och kan resultera i leversvikt, som har en hög dödlighet 1-2. Därför murina studier av leverischemi har blivit ett viktigt forskningsområde genom att ge möjlighet att utnyttja farmakologiska och genetiska studier 3-9. Specifikt villkorliga möss med vävnadsspecifik deletion av en gen (CRE, flox system) ger insikter i rollen av proteiner i vissa vävnader 10-13. På grund av tekniska svårigheter i samband med manuell fastspänning portalen triaden hos möss, utförde vi en systematisk utvärdering med en hängande vikt för portalen triad ocklusion som tidigare har beskrivits 3. Genom att använda en hängande vikt system vi placera en sutur runt vänstra grenen av portalen triaden utan att orsaka någon skada på hepatiska lober, eftersom ävenfinaste klämmor tillgängliga kan orsaka skador levervävnad grund av den nära platsen för levervävnad på kärlen. Dessutom är den högra grenen av den hepatiska triaden fortfarande perfusion således ingen intestinal överbelastning med denna teknik som blodflödet till höger hepatiska loberna bevaras. Vidare är portalen triaden endast manipuleras gång under hela kirurgiska proceduren. Som ett resultat av detta förfarande liknande pre-konditionering, med korta tider av ischemi och reperfusion, kan lätt utföras. Systematisk utvärdering av denna modell genom att utföra olika ischemi och tider reperfusion visade ett nära samband med leverischemi tid med leverskada mätt som alanin (ALAT) och aspartat (ASAT) leveraminotransferasnivåerna serumnivåer 3,9. Sammantaget visar dessa studier bekräftar mycket reproducerbara leverskada vid användning av hängdropp-vikt för hepatisk ischemi och reperfusion intermittent. Således kan denna teknik vara användbar för andra utredare räntored i studier lever ischemi hos möss. Därför videoklippet ger en detaljerad steg-för-steg beskrivning av denna teknik.
Protocol
Allmänna anmärkningar Alla verksamheter ska utföras under en upprätt dissekeringsmikroskop (Leica) och genom att använda en kirurgisk koagulator. Mössen i experimentella och bluff grupper bör matchas i ålder och vikt för att säkerställa jämförbarheten av resultaten. Temperatur, blodtryck, anestesi och vätsketillförsel bör vara stabil och övervakas under hela experimentet.
1. Anestesi och kirurgi
- C57BL / 6 möss bör ligga inom ett åldern 10 till 16 veckor, och de skall ha en jämn matchas i respektive grupp.
- Bedöva möss med natriumpentobarbital (70 mg / kg kroppsvikt intraperitonealt) och bibehålla anestesi med ca. 10 mg / kg / timme natriumpentobarbital. Överdosering kan avsevärt sänka blodtrycket och därmed kan förändra resultaten.
- Ställe möss på ett temperaturreglerat uppvärmda bord (RT, Effenberg, Munchen, Tyskland) med en rektal termometer sond fäst till en termisk responsstyrenheten att bibehålla kroppstemperaturen vid 37 ° C.
- Placera mössen i en liggande position på operationsbordet, med de övre och nedre extremiteter fästa vid bordet med borttagbara tejp.
- Vid överlevnad försök korrekt aseptiska tekniker inklusive klippning av hår, desinfektion av hud med jodoforer (t.ex. Betadine), steril hantering av autoklaverad instrument, och använda masker ett sterila handskar för kirurgen krävs.
2. Portal triaden Ocklusion
- Täck snittet området med mineralolja för att förhindra inandning av mus hår genom att skära huden och därmed förebygga risken för allergier mus hår. Utför mittlinjen laparotomi och anskärning av linea alba upp till den övre änden så att du enkelt kan exponera levern. Om möjligt utföra snitt med en koagulering elektrod (Erbe, ICC50, Tuebingen, Tyskland) för att förhindra blödning.
- Placera uppvärmning bordet med musen i en position som svansen är riktTed till kirurgen. Denna ståndpunkt ger dig den bästa inställningen för att lokalisera triaden och placera suturen.
- Förskjutning tarmen på höger sida med hjälp av en våt kompress bomull tips att exponera portalen triaden.
- Något förskjuta medianen och vänstra loben mot membranet och den högra loben mot tarmen. Som ger dig en tydlig bild av portalen triaden ovan bifurkationen av rätten, median / vänster lober.
- Inspektera noggrant portalen triaden och håll höger lob försiktigt ner med nonchalanta pincett. Som ger dig en fin utsikt på vänster portalen triaden.
- När visuellt identifierad plats nålen med sutur (7/0 nylonsutur, Ethicon, Norderstedt, Tyskland) via en nål hållare under vänster portalen triaden, inklusive den hepatiska artären, lever ven och gallgången från vänster till höger sida av musen.
- Sömmen måste vara noga under triaden. En djupare stygn kan skada vena Vaca sämre som ligger underTriaden. Därför håller de rätta levern loberna ner med pincett för att identifiera vena cava innan du ställer in stygn.
- Ta nålspetsen på höger sida med en pincett och dra försiktigt ur levern område utan att skada levern.
- Fäst vid varje ände av suturen ett Eppendorf-rör (ca 3 g, fylld med vatten) och placera både suturändarna över sutur innehavare. Placera den sutur hållaren distalt av sömmen så att suturen inte interfererar med den högra triaden.
- Genom att applicera vikterna triaden kommer omedelbart ockluderade, vilket orsakar avbrott av blodflödet till de vänstra och median-lober i levern. Framgångsrik ocklusion kan lätt bekräftas genom visuell inspektion av bleka blekning av ischemiska lober. I motsats försvinner färgförändring omedelbart när de hängande vikterna frigörs från polerna och levern är reperfuseras. Denna partiella leverischemi modellen undviker mesenterica trafikstockningar genom att bevara Blood flödet till höger lever loberna.
- Ersätta tarmen in i bukhålan. Håll lever och tarm varm med en våt tuss indränkt med vatten vid 37,0 ° C. Förutom att hålla kroppstemperaturen stabil täcka mössen med kommersiellt tillgänglig mat wrap efter avslutad operation.
- Utför ischemi som krävs per försöksprotokoll. Efter en viss ischemi gången utsläpp vikter och reperfusion av medianinkomsten och vänster lever loberna kommer att påbörjas omedelbart. Denna teknik gör det möjligt att producera reversibel ischemi i möss. Om inga ytterligare ischemi tider kommer att utföras försiktigt bort sutur.
- Tillsätt cirka 400 ^ il natriumklorid i bukhålan 15 minuter före och direkt efter reperfusion. Fortsätta att ersätta vätska var 30 minuter i en mängd av 100 | il för att kompensera vätskeförlust under reperfusion tid.
- För överlevnad försök operationssåret stängs med kontinuerlig sutur av muskeln väggen och huden with en 4/0 sutur.
3. Förändringar i leverperfusion
Följande utfallet parametrar rekommenderas för att bestämma leverskada efter hepatisk ischemi:
Bestäm leverenzymer (t ex ALAT, ASAT) och leverhistologi (H & E färgning) Följande lever ischemi och reperfusion 3,9.
Figur 1 Modell av en hängande vikt för levern ischemi. En hängande viktsystem har inrättats för att framkalla lever ischemi av vänster och median lob 3. (A) Därför caudatus och höger lob var försiktigt separeras från vänster lob. Höger lob var då något flyttats tydligt visa portalen triaden ovan bifurkationen av rätten, median och vänster lober. En 8,0 nylonsutur placerades under vänstra nedsatt triaden. (B) I slutet av varje sutur en liten vikt (3 g Eppendorf TUbes fyllda med vatten) fästes och tillämpas. Leverischemi är synlig genom en färgförändring hos den vänstra och median lob från rött till ljus. Denna experimentella designen gör exakt ocklusion och reperfusion av den vänstra levern triaden genom att tillämpa och släppa viktbelastning.
Figur 2. Effekt av olika tider lever ischemi på alanin (ALAT) och aspartat (ASAT) aminotransferas hos möss. Partiell portal triad ischemi inducerades på angivet (0 - 60 min ischemi). Efter 2 h av reperfusion var ALT (A) och AST (B) mäts. Resultaten uttrycks som medel ± SE av 6 till 7 möss per grupp. * P <0,05 jämfört med 0 min ischemi (bluffkontrollen).
Discussion
Föreliggande studie beskriver en teknik för att utföra ischemi i en murin modell med användning av en hängning-vikt för ocklusion av den vänstra porta hepatis triaden. Även om det är en enkel metod för att lära sig de följande fällor skall tas med i beräkningen. Ett mycket vanligt misstag i början är en djup söm som inkluderar portalen triaden och vena cava. Andningen och hjärtfrekvens avtar inom 15 minuter på grund av ökat motstånd och minskningen i återföra blod till hjärtat vilket resulterar i en tidig död hos möss. Det bästa sättet att förhindra bland annat av vena cava är att lokalisera vena cava innan stygn för att hålla rätt loberna ner med en pincett. En annan viktig fråga är att vikterna är inte tung, vilket kan resultera i för mycket stress på vänster och höger portal rättegång som också stoppar blodflödet till rätt lober. Därför är mängden vatten i Eppendorf-rör bör justeras till musen vikt och ärRAMTIDA innehavare av verk bör placeras distalt från sömmen plats. På den motsatta om vikterna är av lågt blodtryck inte helt stoppas. Båda misstag lätt kan spåras av en ytterligare färgförändring till svagt i höger lob eller otillräcklig färgförändring av median och vänster lober, respektive. Därför lever färgförändringen efter att tillämpa de vikterna bör kontrolleras var 10: e minut. En annan vanlig kirurgisk komplikation är att den skadande av levern med nålen. Därför rätt loberna ska hållas ned med en mild tång så att spetsen av nålen lätt kan ses och tas med en nål hållare. Om dessa fällor i början tas med i beräkningen den hängdropp-vikt för hepatisk ischemi tillhandahåller en mycket reproducerbart skada på grund av ischemi genom att minimera variabiliteten för leverskada associerad med fastspänning av portalen triaden. Genom användning av en hängande vikt-systemet, är portalen triaden endast manipuleras gång under helakirurgiskt ingrepp, vilket orsakar signifikant mindre skada på de hepatiska lober. Dessutom uppträder ingen lever och tarm överbelastning med denna teknik. Mer vävnad trauma sker genom att ta bort och ersätta fartyg klämmor, särskilt med återapplicering av klämman under flera ischemi cykler som under ischemisk prekonditionering. Användningen av hängande vikter som är i en avlägsen plats från levervävnad, enligt våra observationer, ger fördelen av tillförlitlig ocklusion och samtidigt förhindra vävnad trauma på grund av manipulation av lever lober genom återapplicering en klämma. Sammantaget ger denna studie genomförbarheten av hängningen vikt för portalen triad ocklusion under ischemi, vilket minimerar variationen och begränsningar i samband med fastspänning. Därför denna teknik kan vara av intresse för andra forskare som anser att studera leverischemi.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
De nuvarande studierna stöddes av USA: s National Institutes of Health bidrag R01-HL092188, R01-DK083385 och R01HL098294, och Foundation för anestesi utbildning och forskning (FAER) beviljar HKE och DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Forskning Fellowship (GR2121/1- 1) och American Heart Association Bidrag till AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005 (2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
