Summary
Biz portal triad oklüzyonu Asılı ağırlık sisteminin yeni bir fare modelini kurdu. Bu teknik, sıçan karaciğer modellerinde iskemi gelecekteki araştırmalar için yararlı olabilir.
Abstract
Iskemiye bağlı akut karaciğer hasarı, çeşitli klinik prosedürler örneğin karaciğer nakli, karaciğer tümörü rezeksiyonu veya travma onarım sırasında oluşabilir ve yüksek ölüm oranı 1-2 olan karaciğer yetmezliğine neden olabilir. Hepatik iskemi Bu nedenle fare çalışmaları farmakolojik ve genetik çalışmalar 3-9 ile tanışma imkanı sağlayarak önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Özellikle, bir genin doku spesifik silinmesi ile koşullu fareler (CRE, Flox sistemi) özellikle dokularda 10-13 proteinlerin rolünü içine bir anlayış sağlamak. Çünkü elle farelerde portalı üçlü sıkıştırma ile ilgili teknik zorluk, daha önce 3 tarif edilmiştir portal triad oklüzyonu Asılı ağırlık sistemi kullanılarak sistematik bir değerlendirme yapıldı. Asılı ağırlık sistemi kullanılarak ayrıca bu yana, karaciğer lobunda herhangi bir zarar vermeden portal triadı sol kolu etrafında bir sütür yerleştirinmevcut en iyi kelepçeler yüzünden gemilere karaciğer dokusu yakın konumu karaciğer dokusunda hasara neden olabilir. Ayrıca, hepatik üçlünün sağ kolu hala böylece perfüze hiçbir bağırsak tıkanıklığı korunur karaciğer sağ lob kan akışını olarak bu teknik ile ortaya çıkar. Ayrıca, portal triadı sadece bütün cerrahi işlem boyunca bir kez manipüle edilir. Bunun sonucu olarak, prosedürler kolayca yapılabilir, iskemi ve reperfüzyon kısa süreleri ile, ön şartlandırma gibi. Alanin (ALT) ve aspartat (AST) aminotransferaz serum 3,9 olarak ölçülen farklı iskemi ve reperfüzyon kez yaparak bu modeli sistematik değerlendirmesi karaciğer hasarı ile karaciğer iskemi süresinin yakın bir ilişki tespit edilmedi. Hepatik iskemi ve aralıklı reperfüzyon için Asılı ağırlık sistemi kullanılırken birlikte değerlendirildiğinde, bu çalışmaların yüksek oranda tekrarlanabilir karaciğer hasarı onaylayın. Böylece, bu tekniğin diğer araştırmacılar ilgi için faydalı olabilirfarelerde karaciğer iskemi çalışmalarda ed. Bu nedenle, video klibi, bu tekniğin ayrıntılı adım adım açıklamalar sağlar.
Protocol
Genel notlar. Tüm işlemler dik bir mikroskop (Leica) altında ve cerrahi koagülatör kullanılarak yapılmalıdır. Deneysel ve plasebo gruplarında fareler sonuçların karşılaştırılabilir sağlamak için yaş ve ağırlık uyumlu olmalıdır. Sıcaklık, kan basıncı, anestezi ve sıvı yönetiminin istikrarlı ve tüm deney sırasında takip edilmelidir.
1. Anestezi ve Cerrahi
- C57BL / 6 fareleri 10 ila 16 haftalık bir yaş aralığında olmalı ve cinsiyet açısından ayrı gruplar halinde olmalıdır.
- Sodyum pentobarbital (70 mg / kg vücut ağırlığı ip) ile anestezi farelerde ve yaklaşık ile anestezi bakımı. 10 mg / kg / saat sodyum pentobarbital. Aşırı Dozlama önemli ölçüde daha düşük kan basıncı ve böylece sonuçlar değiştirebilir.
- Bir rektal termometre probu ile sıcaklık kontrollü ısıtmalı masa (RT, Effenberg, Münih, Almanya) Yer fareler bir termal geribildirim bağlı37 de vücut sıcaklığını koruyacak şekilde kontrol ° C.
- Çıkarılabilir bant ile tablosu bağlı üst ve alt ekstremitelerin ile cerrahi tabloda bir yatar konumda yerinde fareler,.
- Yaşam deneyleri durumunda saç kırpma, iyodoforlar (örneğin Betadine), otoklavlanmış aletlerin steril işleme ve maskeleri cerrah için steril eldiven kullanarak cilt dezenfeksiyonu dahil olmak üzere uygun aseptik teknikler gereklidir.
2. Portal Triad Tıkanıklığı
- Deri kesme ve böylece fare saç alerji riskini önleyerek fare saç teneffüs önlemek için mineral yağ ile kesi alanı kapsamaktadır. Kolayca karaciğer maruz böylece kadar üst sonuna kadar linea alba orta hat laparotomi insizyonu gerçekleştirin. Mümkünse kanamayı önlemek için bir koagülasyon elektrodu (Erbe, ICC50, Tübingen, Almanya) ile kesi yapar.
- Kuyruk Direc olduğu bir konumda fare ile ısıtma masa yerleştirincerraha ted. Bu pozisyon üçlü yerelleştirilmesine ve dikiş yerleştirmek için en iyi ayarı sağlar.
- Portal triadı ortaya çıkarmak için ıslak bir pamuk uçlu çubuk kullanarak sağ tarafta bağırsak çekilin.
- Biraz diyaframı doğru medyan ve sol lob ve bağırsak doğru sağ lob kaydırır. Yani, sağ / sol medyan lobların çatallanma yukarıda portal triadı net bir görünüm verecektir.
- Dikkatle portal triadı incelemek ve mülayim forseps ile yavaşça aşağı sağ lob tutun. Yani, sol portal triadı güzel bir görünüm verecektir.
- Soldan sağa doğru hepatik arter, hepatik ven ve safra kanalı dahil olmak üzere sol portal triadı altında bir iğne tutucu üzerinden; sonra görsel sütür (Ethicon, Norderstedt, Almanya 7/0 naylon sütür) ile yer iğne tespit Farenin.
- Dikiş üçlü altında yakından olmalıdır. Daha derin bir dikiş altında bulunan vena vaca aşağı yaralayabilirüçlü. Bu nedenle dikiş koymadan önce vena kava tanımlamak için forseps ile karaciğerin sağ lobu basılı tutun.
- Bir forseps ile sağ tarafta iğne ucu almak ve karaciğer zarar vermeden karaciğer alanı dışında hafifçe çekin.
- Sütür bir Eppendorf tüp (su ile dolu yaklaşık 3 g) her bir ucuna takın ve her iki dikiş dikiş sahipleri üzerinde biter yerleştirin. Sütür doğru üçlü karışmaz böylece distalde dikiş dikiş sahibi yerleştirin.
- Ağırlıklar uygulayarak üçlü karaciğer sol ve median lob kan akımı kesintiye neden hemen tıkalı olacak. Başarılı tıkanıklığı kolaylıkla iskemik lobların soluk soluklaşmanın görsel muayene ile teyit edilebilir. Asılı ağırlıkları kutuplar salgılanır ve karaciğer reperfüzyon zaman aksine, renk değişikliği hemen kaybolur. Bu kısmi karaciğer iskemi modeli bloo koruyarak mezenter tıkanıklığı önlerkaraciğer sağ lob d akışı.
- Karın boşluğuna bağırsak değiştirin. 37.0 su ile ıslatılmış ıslak bir bez ile karaciğer ve bağırsak sıcak tutun ° C Ameliyat bittikten sonra piyasada bulunan gıda ambalajlarında ile farelerin kapsayacak vücut ısısını dengede tutmak için ek olarak.
- Deneysel protokol başına gerektiği gibi iskemi gerçekleştirin. Tanımlanmış bir iskemi zamanı bırakılmasından sonra ortanca ve karaciğer sol lob ağırlıkları ve reperfüzyon hemen başlayacaktır. Bu teknik, farelerde tersine çevrilebilir iskemi üreten sağlar. Başka iskemi kez yapılacak ise dikkatle sütür çıkarın.
- 15 dakika önce ve doğrudan reperfüzyon sonrası karın boşluğuna yaklaşık 400 ul sodyum klorür ekleyin. Reperfüzyon süresince sıvı kaybı telafi etmek için 100 ul'lik bir miktarda her 30 dakikada bir sıvı ikame devam etmektedir.
- Sağkalım deneyler için cerrahi yara sürekli kas duvarının sütür ve cilt wi kullanarak kapalı4/0 sütür th.
3. Karaciğer Perfüzyon değişiklikler
Aşağıdaki sonuç parametreleri karaciğer hasarı aşağıdaki hepatik iskemi belirlemek için tavsiye edilir:
Karaciğer enzimleri (örneğin ALT, AST) ve karaciğer histolojisi (H & E boyama) aşağıdaki karaciğer iskemi ve reperfüzyon 3,9 belirleyin.
Şekil 1 karaciğer iskemi için Asılı ağırlık sisteminin Model:. A asılı ağırlık sistemi, sol ve orta lob 3 karaciğer iskemi ikna etmek için kurulmuştur. (A) Bu nedenle kaudat ve sağ lob hafifçe sol lob ayrıldı. Sağ lob açıkça sağ, medyan ve sol lob çatallanma yukarıda portal triadı görüntülemek için hafifçe kaymış oldu. Bir 8.0 naylon sütür sol karaciğer üçlü altına alınmıştır. (B) Her sütür sonunda küçük bir ağırlığı (az 3 g Eppendorf tusu ile doldurulur bes) eklenmiş ve uygulanmıştır. Karaciğer iskemi kırmızıdan soluk için sol ve orta lob bir renk değişimi ile görünür. Bu deneysel tasarım kilo yük uygulamadan ve bırakmadan kesin tıkanma ve sol hepatik üçlünün reperfüzyon sağlar.
Şekil 2. Alanin (ALT) ve aspartat (AST) farelerde aminotransferaz farklı karaciğer iskemi süresinin etkisi. Kısmi portal triad iskemi belirtilen (- 60 dakika iskemi 0) olarak oluşturuldu. Reperfüzyon 2 saat sonra, ALT (A) ve AST (B) ölçüldü. 7 fareler / group - Sonuçlar ortalama ± SE 6 olarak ifade edilir. * P 0 dakika iskemi (sham kontrol) ile karşılaştırıldığında <0.05.
Discussion
Bu çalışmada sol hepatik portal triad oklüzyonu Asılı ağırlık sistemi kullanılarak bir fare modelinde iskemi yapan bir teknik anlatılmaktadır. Bunu öğrenmek için kolay bir yöntem olmasına rağmen şu tuzaklar dikkate alınmalıdır. Başlangıçta bir çok yaygın bir hata portal triadı ve vena kava içeren derin bir dikiş olduğunu. Solunum ve kalp hızı artan direniş ve farelerin erken ölümle sonuçlanan kalp kan dönen azalma nedeniyle 15 dakika içinde yavaşlayacaktır. Vena kava dahil önlemenin en iyi yolu bir forseps ile sağ lobu basılı tutarak dikiş önce vena kava yerelleştirilmesine olduğunu. Bir başka önemli konu ağırlıkları da sağ lob kan akışını durdurur sağ ve sol portal yargılanan çok strese yol açabilir ağır olmamasıdır. Bu nedenle Eppendorf şişe içindeki su miktarı fare ağırlığını ve s üzere ayarlanması gerekmektediruture tutucular dikiş yerinden distal yerleştirilmelidir. Karşısında ağırlıkları düşük kan basıncı için ise tamamen durmuş değil. Her ikisi de hataları kolayca sırasıyla medyan ve sol lob sağ lob veya yetersiz renk değişikliği soluk ilave bir renk değişimi tarafından algılanabilen edilir. Bu nedenle ağırlıklarının uygulanması takiben hepatik renk değişimi her 10 dakikada bir kontrol edilmelidir. Başka bir yaygın cerrahi komplikasyon iğne ile karaciğer yaralanmasına neden olduğunu. Bu nedenle sağ lob iğne ucu rahatlıkla görülebilen ve iğne tutucu ile alınabilir böylece mülayim bir forseps ile basılı tutulmalıdır. Başlangıçta bu zorlukları göz önüne alınırsa hepatik iskemi için Asılı ağırlık sistemi portal üçlünün sıkma ile ilişkili karaciğer hasarının değişkenliği en aza indirerek iskemi nedeniyle yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanma sağlar. Asılı ağırlık sistemi kullanarak, portal triadı sadece bütün boyunca bir kez manipüle edilircerrahi, karaciğer lobunda önemli ölçüde daha az hasara neden olur. Buna ek olarak, herhangi bir hepatik veya bağırsak konjesyon, bu teknik ile ortaya çıkar. Daha fazla doku travması özellikle iskemik önkoşullama sırasında olduğu gibi birden fazla iskemi döngüleri sırasında kelepçe tekrar uygulama ile, damar kelepçeler kaldırarak ve değiştirilmesi ile oluşur. Bir mengene başvurmamız tarafından karaciğer lobların manipülasyon nedeniyle doku travması önlerken, bizim gözlemlerimize göre, karaciğer dokusunda uzak bir konumda ağırlık asılı kullanımı güvenilir tıkanıklığı avantajı sağlar. Birlikte ele alındığında, bu çalışma, germe ile ilişkili değişkenlik ve sınırlamaları en aza indirerek, iskemi sırasında portal triad oklüzyonu Asılı ağırlık sisteminin fizibilite sağlar. Böylece bu teknik hepatik iskemi okullar diğer araştırmacılar için ilgi çekici olabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Mevcut çalışmalar Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitülerinden hibe HL092188-R01, R01-DK083385 ve R01HL098294 ve Anestezi Eğitim ve Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir (FAER) HKE ve DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Araştırma Bursu (için ArtırdıZAGREP GR2121/1- 1) ve AG Amerikan Kalp Derneği Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005 (2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
