Summary
Vi har etableret en ny murine model af en hængende vægt system til portalen triade okklusion. Denne teknik kan være nyttig til fremtidige undersøgelser af iskæmi i murine hepatiske modeller.
Abstract
Akut leverskade på grund af iskæmi, kan forekomme under flere kliniske procedurer, f.eks levertransplantation, levertumor resektion eller traumer reparation og kan resultere i leversvigt, som har en høj dødelighed 1-2. Derfor murine undersøgelser af hepatisk iskæmi er blevet en vigtig forskningsområde ved at give mulighed for at udnytte farmakologiske og genetiske undersøgelser 3-9. Konkret betingede mus med vævsspecifikke sletning af et gen (CRE, FLOX system) giver indsigt i den rolle af proteiner i bestemte væv 10-13. På grund af tekniske vanskeligheder forbundet med manuelt at klemme portalen Triaden i mus, udførte vi en systematisk evaluering under anvendelse af en hængende vægt for portal Triaden okklusion som tidligere er blevet beskrevet tre. Ved at bruge en hængende vægt system, placerer vi en sutur omkring den venstre gren af portalen triade uden at forårsage nogen skade på hepatiske lapper, da ogsåfineste klemmer tilgængelige, kan forårsage hepatisk vævsbeskadigelse på grund af den tætte placering af levervæv til beholderne. Endvidere er den højre gren af den hepatiske Triaden stadig perfunderet således ikke intestinal overbelastning forekommer med denne teknik, blodstrømmen til de rette hepatiske lapper bevares. Endvidere er portalen Triaden kun manipuleres, når hele kirurgiske procedure. Som et resultat heraf vil procedurer forbehandling med korte perioder med iskæmi og reperfusion, kan let udføres. Systematisk evaluering af denne model ved at udføre forskellige iskæmi og reperfusion gange afslørede en tæt korrelation mellem hepatisk iskæmi tid med leverskader, som målt ved alanin (ALT) og aspartat (AST) aminotransferaseniveauer serumniveauer 3,9. Taget sammen viser disse undersøgelser bekræfter yderst reproducerbar leverskade ved anvendelse af hængende vægt for hepatisk iskæmi og intermitterende reperfusion. Således kan denne teknik være nyttig til andre forskere interesseed i leveren iskæmi studier i mus. Derfor videoklippet giver en detaljeret trin-for-trin beskrivelse af denne teknik.
Protocol
Generelle bemærkninger. Alle operationer skal udføres i henhold til en opretstående dissektionsmikroskop (Leica), og ved hjælp af en kirurgisk koagulatoren. Musene i de eksperimentelle og humbug grupper bør følges op i alder og vægt for at sikre sammenligneligheden af resultaterne. Temperatur, blodtryk, anæstesi-og fluid administration bør være stabil og overvåges under hele eksperimentet.
1. Anæstesi og kirurgi
- C57BL / 6 mus bør være inden for aldersgruppen 10 til 16 uger, og de bør være køns-matchede i de respektive grupper.
- Bedøve mus med natriumpentobarbital (70 mg / kg legemsvægt ip) og opretholde anæstesi med ca. 10 mg / kg / time natriumpentobarbital. Overdosering kan i høj grad sænke blodtrykket og dermed kan påvirke resultatet.
- Sted mus på en temperaturstyret opvarmet bord (RT, Effenberg, Munich, Tyskland) med et rektalt termometer probe bundet til en termisk tilbagekoblingcontroller til at opretholde kroppens temperatur på 37 ° C.
- Sted mus i en rygliggende position på operationsdagen tabel med de øvre og nedre ekstremiteter er fastgjort til bordet med aftagelige tape.
- I tilfælde af overlevelse eksperimenter korrekt aseptisk teknik, herunder klipning af hår, desinfektion af huden med iodoforer (f.eks Betadine) og steril håndtering af autoklaveret instrumenter, og ved hjælp af masker et sterile handsker for kirurgen er påkrævet.
2. Portal Triad Okklusion
- Dække snitområdet med mineralolie for at forhindre inhalation af muse hår ved at skære i huden, og således forhindre risikoen for muse hår allergier. Udfør midtlinie laparotomi og incision af linea alba op til den øvre ende, så du nemt kan afsløre leveren. Hvis det er muligt at udføre snittet med en koagulation elektrode (Erbe ICC50, Tuebingen, Tyskland) for at forhindre blødning.
- Placer opvarmning bordet med musen i en position, halen er retningTED for kirurgen. Denne position giver dig den bedste indstilling til at lokalisere triade, og at placere suturen.
- Forskyde tarmen på den højre side ved hjælp af en våd vatpind vatpind at blotlægge portalen triade.
- Let flytte median og venstre lap over membranen og den højre lap mod tarmen. Det vil give dig et klart billede af portalen triaden over forgreningen af rette, median / venstre lapper.
- Kontrollér omhyggeligt portalen triaden og hold den højre lap forsigtigt ned med ligegyldige pincet. Det vil give dig en flot udsigt på venstre portalen triade.
- Når først identificeres visuelt sted nålen med suturen (7/0 nylonsutur, Ethicon, Norderstedt, Tyskland) ved hjælp af en nåleholder under den venstre portalen triade, herunder den hepatiske arterie, hepatisk vene og galdegang fra venstre til højre side på musen.
- Sømmen skal være tæt under triade. En dybere søm kan skade vena VacA inferior som er placeret undertriaden. Derfor holder de rigtige lever lapper ned med pincet til at identificere vena cava, før placere søm.
- Tage spidsen af nålen på den højre side med en pincet og trækkes forsigtigt ud af leveren område uden at beskadige leveren.
- Vedhæfte til hver ende af suturen en Eppendorf-rør (ca. 3 g, fyldt med vand) og placere både sutur ender i sutur holdere. Anbring sutur indehaveren distalt af sømmen, således at suturen ikke interfererer med den rette triade.
- Ved at anvende vægte triaden bliver umiddelbart okkluderet, forårsager afbrydelse af blodforsyning til venstre og median lapper i leveren. Vellykket okklusion kan let bekræftes ved visuel inspektion af bleg blegning af iskæmiske lapper. I modsætning hertil straks ændringen af farven forsvinder, når de hængende vægte frigives fra polerne, og leveren er reperfunderes. Denne delvise hepatisk iskæmi model undgår mesenterial overbelastning ved at bevare Blood flow til de rigtige lever lapper.
- Erstatte tarmen ind i bughulen. Hold leveren og tarmen varm med en våd vatpind fugtet med vand ved 37,0 ° C. Ud over at holde kropstemperatur stabil dække musene med kommercielt tilgængelige føde omvikling efter endt kirurgi.
- Udføre iskæmi som kræves per eksperimentel protokol. Efter en defineret iskæmi tid frigivelse vægtene og reperfusion af median og venstre lever lapper vil begynde straks. Denne teknik tillader produktion af reversibel iskæmi i mus. Hvis ingen yderligere iskæmi gange skal udføres omhyggeligt fjerne suturen.
- Der tilsættes ca 400 pi natriumchlorid i bughulen 15 minutter før og umiddelbart efter reperfusion. Med at erstatte fluiden hver 30 minutter i en mængde på 100 ul at kompensere fluidtab under reperfusion tid.
- For overlevelse eksperimenter såret er lukket ved hjælp af kontinuerlig sutur af musklen væg og hud with en 4/0 suturen.
3. Ændringer i Lever Perfusion
Til følgende resultat parametre anbefales at bestemme leverskade følgende nedsat iskæmi:
Bestem leverenzymer (fx ALT, AST) og lever histologi (H & E farvning) Følgende lever iskæmi og reperfusion 3,9.
Figur 1 Model af en hængende vægt system til leveren iskæmi:. Et hængende vægt system er blevet etableret for at fremkalde lever iskæmi i venstre og median lap 3. (A) er derfor caudatus og højre lap blev forsigtigt skilt fra venstre lap. Den højre lap var så lidt forskudt for klart at se portalen triaden over forgreningen af højre, median og venstre lapper. En 8,0 nylonsutur blev anbragt under den venstre hepatiske triade. (B) Ved afslutningen af hver sutur en lille vægt (3 g Eppendorf tuBES fyldt med vand) blev fastgjort og anvendes. Hepatisk iskæmi er synlige ved en farveændring i den venstre og median lap fra rød til bleg. Denne eksperimentelle design tillader præcis okklusion og reperfusion af venstre hepatiske triade ved påføring og frigivelse af vægtbelastning.
Figur 2. Virkning af forskellige lever iskæmi gange på alanin (ALT) og aspartat (AST) aminotransferase i mus. Delvis portal Triaden iskæmi blev induceret som anført (0 - 60 min iskæmi). Efter 2 timer for reperfusion, blev ALT (A) og AST (B) måles. Resultaterne er udtrykt som middel ± SE 6 - 7 mus / gruppe. * P <0,05 sammenlignet med 0 min iskæmi (sham kontrol).
Discussion
Den foreliggende undersøgelse beskriver en teknik til udførelse af iskæmi i en murin model ved hjælp af en ophængning vægt for okklusion af den venstre hepatiske portalen triade. Selvom det er en let metode til at lære følgende fælder bør tages i betragtning. En meget almindelig fejl i starten, er en dyb søm, der omfatter portal triaden og vena cava. Den vejrtrækning og puls vil bremse inden for 15 minutter som følge af øget modstand, og faldet i at vende tilbage blod til hjertet resulterer i en tidlig død af mus. Den bedste måde at forhindre, herunder af vena cava er at lokalisere vena cava, før sting ved at holde de rigtige lapper ned med en pincet. Et andet vigtigt spørgsmål er, at vægtene ikke er for tung, hvilket kan resultere i for meget stress på venstre og højre portal retssag, som også stopper blodtilførslen til de rigtige lapper. Er mængden af vand i Eppendorf hætteglas bør justeres til musen vægt og sOMMENDE indehavere skal placeres distalt fra søm placering. På den modsatte, hvis vægtene er til lavt blodtryk ikke helt standset. Begge fejl er let påviselig ved en yderligere farveændring til svagt af den højre lap eller utilstrækkelig farveændring af median-og venstre lapper, hhv. Derfor hepatiske farveændring efter anvendelse af vægte skal kontrolleres hver 10 minutter. En anden almindelig kirurgisk komplikation er beskadige af leveren med nålen. Derfor de rette fligene holdes nede med en mild pincet, således at spidsen af nålen let kan ses taget med en nåleholder. Hvis disse faldgruber i begyndelsen der tages højde for hanging-vægten for hepatisk iskæmi tilvejebringer en særdeles reproducerbar skade som følge af iskæmi ved at minimere variabilitet af leverskade i forbindelse med fastholdelse af portalen triade. Ved anvendelse af en hængende vægt system er portalen Triaden kun manipuleres, når helekirurgisk procedure, der forårsager signifikant mindre skade på de hepatiske lapper. Derudover forekommer der ikke lever eller tarm overbelastning med denne teknik. Mere vævstraume sker ved at fjerne og udskifte fartøjets klemmer, især med genanvendelse af klemmen i multiple iskæmi cyklusser som under iskæmisk prækonditionering. Anvendelse af hængende vægt, der er i et fjerntliggende sted fra levervæv ifølge vores observationer, tilvejebringer den fordel, pålidelige okklusion og samtidig forhindre vævstraume grund manipulation af leveren lapper ved genanvendelse af en klemme. Tilsammen den nuværende undersøgelse giver muligheden for ophængning vægt system til portalen treklang okklusion under iskæmi, minimere variabilitet og begrænsninger i forbindelse med fastspænding. Således denne teknik kunne være af interesse for andre forskere, der mener at studere hepatisk iskæmi.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
De foreliggende undersøgelser blev støttet af United States National Institutes of Health tilskud R01-HL092188, R01-DK083385 og R01HL098294, og Institut for Anæstesi Uddannelse og Forskning (FAER) Tilskud til HKE og DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Research Fellowship (GR2121/1- 1) og American Heart Association Grant til AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005 (2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
