Summary
We hebben een nieuw muizenmodel van een opknoping gewicht systeem voor het portal triade occlusie. Deze techniek kan nuttig zijn voor toekomstige onderzoeken ischemie muizen lever modellen.
Abstract
Acute leverschade als gevolg van ischemie kan optreden tijdens een aantal klinische procedures, bijvoorbeeld levertransplantatie-, lever-resectie van de tumor of trauma reparatie en kan leiden tot leverfalen, die een hoog sterftecijfer 1-2 heeft. Daarom muizen studies van lever-ischemie zijn een belangrijk gebied van onderzoek door het verstrekken van de mogelijkheid om gebruik te maken farmacologische en genetische studies 3-9. In het bijzonder, voorwaardelijke muizen met weefsel-specifieke verwijdering van een gen (CRE, Flox systeem) geven inzicht in de rol van eiwitten in bepaalde weefsels 10-13. Vanwege de technische problemen in verband met het handmatig vastzetten van de portaalsite triade in muizen, hebben we een systematische evaluatie met behulp van een hangende gewicht voor portal triade occlusie die hierboven zijn beschreven 3. Door het gebruik van een hangende gewicht systeem plaatsen we een hechting rond de linker tak van het portaal triade zonder enige schade aan de lever lobben, omdat ook debeste klemmen beschikbaar kan leiden tot lever-weefselbeschadiging als gevolg van de nauwe locatie van leverweefsel van de schepen. Bovendien is de juiste tak van de lever triade dus nog een doorbloed geen intestinale congestie voordoet met deze techniek als de bloedstroom naar de juiste lever lobben behouden blijft. Verder is de poort drietal eenmaal gemanipuleerd de gehele chirurgische ingreep. Hierdoor procedures zoals voorbewerkingsfactor, met korte tijd van ischemie en reperfusie, gemakkelijk kan worden uitgevoerd. Systematische evaluatie van dit model door het uitvoeren van verschillende ischemie en reperfusie keer bleek een nauwe samenhang van lever ischemie tijd met beschadiging van de lever zoals gemeten door alanine (ALT) en aspartaat (AST) aminotransferase serumspiegels 3,9. Al deze onderzoeken bevestigen zeer reproduceerbare leverbeschadiging bij gebruik van de ophanging-gewicht voor lever-ischemie en reperfusie onderbroken. Zo kan deze techniek kan ook in andere onderzoekers belanged in de lever ischemie studies in muizen. Daarom videoclip een gedetailleerde stap voor stap beschrijving van deze techniek.
Protocol
Algemene opmerkingen. Alle handelingen moeten worden uitgevoerd onder een rechte ontleden microscoop (Leica) en met behulp van een chirurgische coagulator. De muizen in de experimentele en sham groepen moeten worden afgestemd op leeftijd en het gewicht om de vergelijkbaarheid van de resultaten te garanderen. Temperatuur, bloeddruk, verdoving en toediening van vocht moet stabiel zijn en gecontroleerd gedurende het hele experiment.
1. Anesthesie en chirurgie
- C57BL / 6 muizen dient binnen een leeftijd van 10 tot 16 weken en zij geslachtsgerelateerde in de respectieve groepen.
- Verdoof muizen met natrium-pentobarbital (70 mg / kg lichaamsgewicht ip) en onderhouden van anesthesie met ca. 10 mg / kg / h natriumpentobarbital. Overdosering kan een significante verlaging van de bloeddruk en kan dus veranderen de resultaten.
- Plaats muizen op een temperatuur verwarmd tafel (RT, Effenberg, München, Duitsland) met een thermometer rectale probe aan een thermische terugkoppelingcontroller instantie temperatuur op 37 ° C.
- Plaats muizen in een liggende positie op de operatie tafel, met de bovenste en onderste ledematen aan de tafel met verwijderbare tape.
- In het geval van overleving experimenten de juiste aseptische technieken, waaronder knippen van het haar, desinfectie van de huid met jodoforen (bijv. Betadine), steriele behandeling van geautoclaveerd instrumenten, en het gebruik van maskers een steriele handschoenen voor de chirurg nodig zijn.
2. Portal Triad Occlusie
- Bedek de incisie met minerale olie om inademing van de muis haar te voorkomen door het snijden van de huid en daarmee het voorkomen van het risico van de muis haar allergieën. Voer middellijn laparotomie en incisie van de linea alba tot aan de bovenkant, zodat u makkelijk bloot de lever. Indien mogelijk uitvoeren van de incisie met een coagulatie elektrode (Erbe, ICC50, Tübingen, Duitsland) om het bloeden te voorkomen.
- Plaats de verwarming tafel met de muis in een positie dat de staart richting isbonden met de chirurg. Die positie biedt u de beste instelling te lokaliseren de triade en om de hechting te plaatsen.
- Verplaats de darm aan de rechterkant met behulp van een natte wattenstaafje wattenstaafje om de portal triade bloot te leggen.
- Enigszins verschuiven de mediaan en de linker kwab de richting van het membraan en de rechter kwab de richting van de darm. Dat geeft u een duidelijk beeld van de portal triade boven de splitsing van recht, mediaan / links lobben.
- Inspecteer de portal triade en houd de juiste kwab zachtjes neer met saai tang. Dat geeft je een mooi uitzicht op de linker-portaal triade.
- Zodra visueel bepaalde plaats de naald met de hechting (7/0 nylon hechtdraad, Ethicon, Norderstedt, Duitsland) via een naald houder onder de linker-portaal triade, met inbegrip van de leverslagader, lever-ader, en galwegen van links naar rechts van de muis.
- De steek is op de voet onder de triade. Een diepere steek kan schade toebrengen aan de vena Vaca inferieure, die zich onderde triade. Daarom houdt u de juiste lever lobben met de tang van de vena cava te identificeren voordat het plaatsen van de steek.
- Neem de punt van de naald aan de rechterkant met een pincet en trek het voorzichtig uit van de lever ruimte zonder te verwonden de lever.
- Bevestig aan elk uiteinde van de hechting een Eppendorf-buis (ca. 3 g, gevuld met water) en leg beide hechtingen uiteinden over hechting houders. Plaats de hechting houder distaal van de steek, zodat de hechting niet interfereert met de juiste triade.
- Door het toepassen van de gewichten van de triade is direct occlusie, waardoor onderbreking van de bloedtoevoer naar de linker-en mediaan lobben van de lever. Succesvolle occlusie kan eenvoudig worden bevestigd door visuele inspectie van bleke blancheren van de ischemische lobben. In tegenstelling tot de verandering van de kleur verdwijnt onmiddellijk wanneer de opknoping gewichten worden bevrijd van de polen en de lever wordt gereperfundeerd. Deze partiële lever-ischemie model vermijdt mesenteriale congestie door het behoud van Blood stroom naar de juiste lever lobben.
- Vervang de darm in de buikholte. Houd de lever en darm warm met een nat wattenstaafje gedrenkt in water bij 37,0 ° C. Naast het houden van de lichaamstemperatuur stabiel te bedekken met de muizen in de handel verkrijgbare voedsel wrap na het beëindigen van de operatie.
- Voer ischemie zoals vereist per experimentele protocol. Na een bepaalde ischemie tijd de release van de gewichten en reperfusie van de mediaan en de linker lever lobben zal onmiddellijk beginnen. Deze techniek kan produceren reversibele ischemie in muizen. Als er geen verdere ischemie keer zal worden uitgevoerd verwijder voorzichtig de hechtdraad.
- Voeg ongeveer 400 pi natriumchloride in de buikholte 15 minuten voor en direct na reperfusie. Ga verder om de vloeistof te vervangen om de 30 minuten in een hoeveelheid van 100 pi tot vochtverlies te compenseren tijdens de reperfusie tijd.
- Om te overleven experimenten de chirurgische wond is gesloten met een continue hechting van de spierwand en de huid with 4/0 hechtdraad.
3. Veranderingen in leverperfusie
De volgende uitkomstmaten worden aanbevolen om leverbeschadiging volgende lever ischemie te bepalen:
Bepaal leverenzymen (bv. ALT, AST) en de lever histologie (H & E kleuring) volgende lever ischemie en reperfusie 3,9.
Figuur 1 Model van een hangende gewicht voor de lever ischemie:. Een opknoping gewicht systeem is opgezet om de lever ischemie van het linker-en mediane lob 3 induceren. (A) Daarom is de caudate en rechter kwab werden zachtjes gescheiden van de linker kwab. De rechter kwab was toen iets verschoven om duidelijk te bekijken het portaal triade boven de splitsing van recht, mediaan en links lobben. Een 8,0 nylon hechtdraad werd geplaatst onder de linker lever triade. (B) op het einde van elke hechtdraad een gewicht (3 g Eppendorf tuBES gevuld met water) werd bevestigd en toegepast. Lever-ischemie is zichtbaar door een kleurverandering van de linker-en mediane lob van rood tot licht. Deze experimentele ontwerp zorgt voor een precieze occlusie en reperfusie van de linker lever triade door toepassing van en het loslaten van de gewichtsbelasting.
Figuur 2. Effect van verschillende lever ischemie keer op alanine (ALT) en aspartaat (AST) aminotransferase in muizen. Gedeeltelijke portal triade ischemie werd geïnduceerd zoals aangegeven (0 - 60 min ischemie). Na 2 uur van reperfusie werden ALT (A) en AST (B) gemeten. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± SE van 6-7 muizen / groep. * P <0,05 in vergelijking met 0 min ischemie (sham controle).
Discussion
Deze studie beschrijft een techniek van het uitvoeren van ischemie in een muismodel met behulp van een ophanging-gewicht voor occlusie van de linker lever portal triade. Hoewel het een eenvoudige methode te leren de volgende problemen worden gehouden. Een veel voorkomende fout in het begin is een diepe steek, die het portaal triade en de vena cava omvat. De ademhaling en de hartslag vertraagt binnen 15 minuten, vanwege de verhoogde weerstand en de daling van terug te keren bloed naar het hart leidt tot een vroege dood van de muizen. De beste manier om de opneming van de vena cava te voorkomen, is het lokaliseren van de vena cava voordat de steek door te oordelen de juiste lobben neer met een pincet. Een ander belangrijk punt is dat de gewichten niet te zwaar wat kan leiden tot te veel stress op de linker-en rechter-portaal proces dat ook de bloedtoevoer stopt aan de rechterkant lobben. Daarom is de hoeveelheid water in de Eppendorfbuisjes moet worden aangepast aan de muis gewicht en de sOEKOMSTIGE houders moeten distaal geplaatst worden vanaf de steek locatie. Aan de andere als de gewichten zijn lage bloeddruk niet geheel gestopt. Beide fouten gemakkelijk door een extra kleurverandering bleek het recht lob of onvoldoende kleurverandering van de mediaan en linker lobben respectievelijk. Daarom is de lever kleur veranderen na de toepassing van de gewichten moeten worden gecontroleerd om de 10 minuten. Een andere veel voorkomende chirurgische complicatie is het verwonden van de lever met de naald. Het recht lobben worden vastgehouden met een neutrale tang zodat het uiteinde van de naald kan gemakkelijk worden gezien en die met een naaldhouder. Indien deze valkuilen in het begin rekening wordt gehouden met de ophanging gewicht voor lever ischemie is een zeer reproduceerbare letsel door ischemie door het minimaliseren van variabiliteit leverbeschadiging verbonden klemmen van het portaal triade. Door een ophanging gewicht systeem wordt het portaal drietal eenmaal gemanipuleerd de gehelechirurgische ingreep, waardoor minder schade aan de lever lobben. Bovendien is geen lever of darm congestie optreedt met deze techniek. Meer weefsel trauma gebeurt door het verwijderen en terugplaatsen schip klemmen, vooral met hernieuwde toepassing van de klem tijdens meerdere cycli ischemie, zoals tijdens de ischemische preconditionering. Het gebruik van opknoping gewichten die in een afgelegen locatie van het leverweefsel, volgens onze waarnemingen, biedt het voordeel van betrouwbare occlusie, terwijl het voorkomen weefsel trauma als gevolg van manipulatie van de lever lobben door hernieuwde toepassing van een klem. Al met al, de huidige studie biedt haalbaarheid van het hangende gewicht voor portal triade occlusie tijdens ischemie, het minimaliseren van de variabiliteit en de beperkingen die verbonden zijn met klemmen. Dus deze techniek interessant kunnen zijn voor andere onderzoekers die van mening bestuderen van lever-ischemie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De huidige studies werden ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health subsidie R01-HL092188, R01-DK083385 en R01HL098294, en de Stichting voor Anesthesie Onderwijs en Onderzoek (FAER) subsidies voor de HKE en DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Research Fellowship (GR2121/1- 1) en de American Heart Association Grant aan AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005 (2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
