Summary
הטכניקה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הצומת לימפה מפשעתי (LN) הוא התווה. טכניקה כזו מאפשרת בזמן אמת,
Abstract
בלוטות הלימפה (של LN), הנמצא בכל הגוף, הם מרכיב בלתי נפרד של מערכת החיסון. הם משמשים כאתר לזירוז של תגובה חיסונית אדפטיבית, ולכן, את התפתחותם של תאים מפעיל. ככזה, LNs הם המפתח הלחימה פתוגנים הפולשים ושמירה על הבריאות. הבחירה של LN ללמוד מוכתב על ידי נגישות המודל הרצוי; הלימפה מפשעתי ממוקם היטב ובקלות תומך במחקרים של מודלים רלוונטיים ביולוגית של העור וזיהומים הרירית באיבר המין.
LN מפשעתי, כמו LNs כל, יש רשת ענפה כלי הדם המספקים לו את הדם. באופן כללי, זו רשת כלי הדם כוללת את עורקיק להאכיל העיקרי של LN כי לאחר מכן סניפים הזנות venules אנדותל גבוהה (HEVs). HEVs מתמחים עבור קידום הסחר של תאים חיסוניים לתוך LN במהלך הומאוסטזיס והן זיהום. איך HEVs להסדיר סחר לתוך LN תחת שניהם בנסיבות אלה הוא אזור של חיפושים אינטנסיביים. להאכיל LN עורקיק, יש השפעה ישירה על הזרם HEVs והוא האספקה העיקרי של חומרים מזינים בדם עשיר התא לתוך LN. יתר על כן, שינויים עורקיק ההזנה מעורבים בקידום אינדוקציה של תגובה חיסונית אדפטיבית. Microvasculature LN יש חשיבות ברור בשמירה על אספקת הדם האופטימלי LN ועל ויסות זרם לתוך תא החיסון LN, אשר הם מרכיבים חיוניים לתפקוד תקין LN התגובה החיסונית לאחר מכן.
היכולת ללמוד את microvasculature LN in vivo היא המפתח הבהרת איך את המערכת החיסונית ואת microvasculature אינטראקציה ומשפיעים זה על זה בתוך LN. כאן, אנו מציגים שיטה בתחום ההדמיה vivo של הצומת לימפה מפשעתי. אנו מתמקדים הדמיה של microvasculature של LN, תשומת לב מיוחדת שיטות להבטיח את המחקר של כלי בריא, היכולת לשמור על דימות של כלי קיימא במשך מספר שעות, וכימות של גודל כלי הדם. שיטות זלוף של microvasculature עם תרופות vasoactive כמו גם את הפוטנציאל לאתר ולכמת תנועה הסלולר מוצגים גם.
מיקרוסקופיה Intravital של LN מפשעתי מאפשר הערכה ישירה של כלי הדם פונקציונליות בזמן אמת ממשק של ממשק ישיר בין תאים חיסוניים, LN, ואת microcirculation. טכניקה זו פוטנציאל להיות בשילוב עם טכניקות החיסונית רבים וסימון התא ניאון כמו גם מניפולציות כמו ללמוד vasculature של LNs אחרים.
Protocol
1. מגיב הכנה
- ריאגנטים לשמש לאורך הניסוי אמור להיות מוכן לפני תחילת פרוטוקול כירורגית. שים לב כי כל הפתרונות נעשו באמצעות טכניקה סטרילית.
- תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) היא המוכנה ביותר שני רכיבים: תמיסת מלח בסיסי ביקרבונט פתרון נתרן. הכן שני פתרונות בריכוז 20X ולאחסן ב 4 ° C. סודיום ביקרבונט ב 20X הוא 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) ואת תמיסת מלח בריכוז הבסיסי הוא 20X 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), ו 23.4mM MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). הפתרונות צריכים להיות מוכנים ב DH 2 O וכימיקלים יש להוסיף אחד בכל פעם ובחש עד פתרון ברור לפני הוספת כימיים הבא
- הכן 2L של PSS על ידי דילול כמויות שוות של סודיום ביקרבונט ו תמיסת מלח בסיסי דילול ריכוז 1X (שני לדלל 2L של PSS 100 מ"ל של נתרן ביקרבונט כל תמיסת מלח בסיסי DH 2 O
- נפח 2L מקום בקבוק המכיל PSS ו PSS ב 37 ° C אמבט מים. לאזן את הפתרון עם 5% CO 2 / גז חנקן איזון 1 שעות לפני תחילתו של הליך כירורגי.
- כימיקלים Vasoactive (Phenylephrine דוגמה, אצטילכולין, nitroprusside נתרן) מוכנים הטובה ביותר בריכוז 1M ב dH2O ומאוחסנים 100μl aliquots ב -20 ° C.
2. הכנת בעלי חיים
- קבע את משקל העכבר לנהל את המינון הראשוני של נתרן pentobarbital ב 90mg/kg בזריקה intraperitoneal. לאורך כל ההליך העכבר נמצא במעקב מתמיד על מטוס הרדמה דרך קמצוץ הבוהן בחינה מדוקדקת של קצב הנשימה. זריקות נוספות של נתרן pentobarbital צריכה להינתן לפי הצורך ב 20mg/kg לשמור על מטוס הרדמה. המטוס של הרדמה כירורגית מתוחזק לפי תקנות פדרליות מוסדיים כפי שתואר בפרוטוקול טיפול בבעלי חיים אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (ACUC) מאוניברסיטת צפון לפנה"ס.
- הסרת שיער מאזור הבטן האגף / ירך על ידי גילוח. הסרת השיער הנותר משוחרר על ידי אלכוהול ספוגית ומלטף את האזור עם הקלטת. זה די כמו הליך זה הוא ניסיוני סופנית.
- מניחים את העכבר על לוח כירורגית ברור בעמדה פרקדן ולצרף את העכבר ללוח ידי מקליטה כל שודד דרכים על הלוח. טמפרטורת הגוף נשמרת באמצעות מנורת חום חיצוני לפקח באמצעות מדחום רקטלי, כדי להבטיח כי היפותרמיה אינו מתרחש כתוצאה הרדמה.
3. הליך כירורגי
- במהלך ההליך הכירורגי כולו להבטיח רקמה חשוף נשמר תמיד superfused עם פתרון equilibrated PSS התחמם. חשוב גם לא ליצור קשר עם vasculature של עניין עם מכשירי ניתוח או לפצוע את ידי הצבת כלי להכריח אותם הרבה על ידי מניפולציה רקמת שומן ורקמת חיבור סביבם.
- מניחים את העכבר מתחת למשטח הביתור. ביצוע חתך קו האמצע על פני השטח הגחון של חלל הבטן לסגת העור כלפי עמוד השדרה של העכבר.
- לאחר העור הוא חזר בו, כך LN גלוי בקלות, להצמיד את העור על בסיס של 184 Sylgard שקוף.
- הסרת שכבה דקה של רקמת חיבור שכיסה את האזור סביב LN
- נקה את שכיסה רקמה שומנית ו להקיף את הלימפה עד מיטה כלי הדם חשוף. הקטע העורקי המרכזי מניח הסמוכים LN והוא overlayed כלל על ידי ורדיד. הניתוח כולו נמשך 30 דקות בקירוב.
4. הדמיה וניתוח כלי השיט
- לאחר קטע של כלי הריבית חשוף מתחת למשטח הביתור, מאובטח על הכנת המיקרוסקופ intravital. שים לב בעלי חיים נשאר על הלוח תוך ניתוח ברור על המיקרוסקופ intravital לאורך כל תקופת הניסוי. טמפרטורת הגוף נשמרת באמצעות מנורת החום שנמדד באמצעות מדחום רקטלי כמתואר בסעיף במהלך הניתוח. המטוס הרדמה מנוטר גם במהלך הניסוי, כמתואר בסעיף 2.1.
- הגדרת superfusion קווי יניקה. Superfusion של PSS מתרחשת על ידי כוח המשיכה להאכיל מן המאגר, לתוך מאגר המים מחוממים ז'קט (מקטורן מים מופץ ומחומם waterbath במחזור) להיות perfused על ידי חנקן 5% CO 2 מאוזנת, לאורך קו טפטוף בשיעור של 10 מ"ל / min. קו יניקה יש להשתמש כדי להמשיך למשוך PSS superfused הרחק ההכנה. שים לב לפני הניסוי קווי יניקה ז'קט מים מנקים ביסודיות מאוחסן לאחר כל ניסוי. זה מבטיח סטריליות לקראת הניסוי הבא.
- בדוק את הטמפרטורה של PSS superfusing. כוונו את הטמפרטורה שלבמחזור אמבט מים ו / או שיעור superfusion PSS כדי להשיג טמפרטורה של ~ 37 ° C על פני ההכנה.
- אפשר vasculature לאזן עם PSS במשך לפחות 60 דקות לכמת את קוטר כלי שיט באמצעות קליפר וידאו. בדרך כלל, קוטר כלי צריך להיקבע בנקודות מרובות (למשל, בגיל 40, 50, ו - 60 דקות) כדי להבטיח את כלי התייצב.
- להעריך את הבריאות של כלי השיט באמצעות אגוניסט השריר החלק ספציפיים (דוגמה Phenylephrine, PE) ו אגוניסט ספציפי האנדותל (אצטילכולין דוגמה, ACH). ריכוז של אגוניסט צריך להיות מותאם בהתאם אגוניסט, אבל עבור PE ו אח כלי יש להעריך את ריכוז כל אחד על ידי תוספת מצטברת (10-5M ל 10-9M) כדי superfusate. כל יישום אגוניסט צריכים להיות מופרדים על ידי בשלב לשטוף (בדרך כלל 30 דקות) באמצעות כלי PSS עד חוזר בקוטר מנוחה.
- בעקבות הערכה של בריאות כלי שיט, סמים vasoactive הבאים, תיוג פלורסנט, ותא התחקות ניסויים ניתן לבצע.
- לאחר תום הניסוי בבעלי חיים ניתנת מנת יתר של נתרן pentobarbital. החיה מנוטר על מנת להבטיח כי אז אין תגובה לצבוט הבוהן חוסר תנועה בדרכי הנשימה או פעימות לב. בשלב כזה זה מלווה נקע בצוואר הרחם.
5. נציג תוצאות:
לאחר תקופת הכנה איזון אמור להניב תמונה ברורה המאפשרת זיהוי של עורקיק והן ורדיד המספקת את הלימפה מפשעתי. לא צריך להיות בתאי השומן המקיפים את כלי מינימלי כדי לאפשר קירות עורקיק ו ורדיד להיות נצפו בבירור את מחוגה וידאו להתווסף לחישוב קוטר כלי הדם. נקודת נפרד הכנה מוצלחת היא עורקיק יש היצע עשיר של דם נע לומן, וכי יש מידה משמעותית של הטון וסקולרית (כלומר עורקיק יש את היכולת vasoconstrict ו vasodilate להחליק שרירים אגוניסטים ספציפיים אנדותל בהתאמה) .
באיור 1. תמונה מיקרוסקופית של Intravital מפשעתי הלימפה להאכיל עורקיק (חץ אדום) להאכיל את הלימפה equilibrated עם תמיסת מלח פיזיולוגית לרוץ בצד ורדיד הראשי (חץ ירוק).
איור 2. בתגובה vasoactive רגיל עד phenylephrine superfused (PE) על ידי תוספת מצטברת של ריכוזי מלח פיזיולוגיים 10 -9 מ -5 עד 10 מ ' הנוכחות של vasoconstriction החזקה היא המעידים על תפקוד נורמלי שריר חלק נוכח עורקיק.
איור 3. בתגובה vasoactive רגיל עד superfused אצטילכולין (ACH) על ידי תוספת מצטברת של ריכוזי מלח פיזיולוגיים 10 -9 מ -5 עד 10 מ ' הנוכחות של התרחבות חזק הוא רמיזות של ההווה נורמלי תפקוד האנדותל ב עורקיק.
Discussion
מיקרוסקופיה Intravital של הצומת לימפה מפשעתי המובא כאן מספק את היכולת microvasculature תמונה של הצומת לימפה ב-vivo. לכן, זה מקל על אמצעי תצפית ישירה בזמן אמת. הדמיה של microvasculature LN הוא אתר ייחודי המאפשר אחד כדי ללמוד את הממשק בין התגובה החיסונית ועל כלי הדם. באמצעות הכנה זו, ניתן להתמקד כוון במיוחד התגובה החיסונית, שינויים בכלי הדם, או על אינטראקציה בין השניים.
כמו עם כל הגישות ניסיוני, מיקרוסקופיה intravital תקן יש גם יתרונות ומגבלות. תקן IVM, כגון הכנת המתואר כאן, יכול בקלות להיות שונה, ואת כבר הוכיח בעבר על ידי המחברים, כדי לאפשר מיקרוסקופיה epifluorescent באמצעות הקדמה של צבעי ניאון נותב או אוכלוסיות תאים הנקרא. למרות IVM רגיל לא נותן את האפשרות של הדמיה תלת מימדי ו התחקות כגון תינתן על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים או אנגיוגרפיה, מעקב תא מושגת עדיין בשני ממדים המאפשר התא אל התא אל התא vasculature אינטראקציה להיות צפו לכמת ובשיתוף עם הממשל ב-vivo ו מכתים הבאים עם נוגדנים ניאון ניתן להשתמש כדי לתת נתונים על ביטוי החלבון / סמן בזמן אמת.
יש לציין, טכניקות חלופיות הדמיה דורשים סביבה סטטית עבור תמונות, לחיצה על אזור הניתוח או תוספת של coverslip על הכנת שטוח יש צורך לעיתים קרובות. זה מגביל, אם לא מבטל, את היכולת פעיל perfuse מתווכים וסקולרית או אחר על הכנת להעריך שלמות כלי הדם ופיזיולוגיה וכו ', או שימוש בטכניקות אחרות, כגון התרחבות ניסויים שנערכו במסגרת הכנת IVM. יתר על כן, תקן IVM אינה דורשת הכנה שטוח לחלוטין, אינו מושפע תנועה, כמו זה שנוצר על ידי הנשימה של החיה. תקן זה מאפשר IVM לשמש באזורים כירורגית יותר עם reproducibility יותר. זה בא לידי ביטוי על ידי הכנה צומת מפשעתי הלימפה המתוארת כאן. בהתחשב בגודל ובצורה של הצומת לימפה, הכנת לא ניתן שטוח מבלי לפצוע את הרקמות ואת המיקום של הצומת מעורר תנועה משמעותית עקב הנשימה של בעלי חיים. סוגיות אלה יהיה קשה להתגבר בשיטות אחרות, אבל הם עסקו בקלות באמצעות הכנה IVM תקן תיאר.
לסיכום, הכנת שפורטו לעיל ניתן לשלב עם כל מספר של אחרים ביוכימיים, כלי הדם, ו / או טכניקות החיסונית כגון העברה של תת קבוצות של מופעל או התאים שכותרתו, אינדוקציה של היפוקסיה, ושוב הביטוי של דלדול של מתווכים וסקולרית. עם זאת, יישומים נוספים תלויים בריאות הכנה הראשונית. לכן, חיוני תמיד לבדוק את בריאותם של vasculature עתה צילמו ומוערכת. נקודות המפתח להשגת הכנה הבריאות הבטחת הכנה היא perfused הזמן בטמפרטורת הגוף עם PSS equilibrated ומזעור מגע ומתח דגש על אזור הניתוח במהלך הניתוח.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות, קרן קנדה עבור חדשנות, באוניברסיטה של קולומביה הבריטית המרכז לחקר דם אוניברסיטת צפון לפנה"ס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
