Summary
En teknik för att utföra intravital mikroskopi av inguinal lymfkörtlar (LN) beskrivs. Sådan teknik kan i realtid,
Abstract
Lymfkörtlar (LN: s), som finns i hela kroppen, är en integrerad del av immunförsvaret. De fungerar som en plats för induktion av adaptiva immunsvar och därmed utvecklingen av effektor celler. Som sådan, LNS är nyckeln till kampen mot invaderande patogener och bibehålla hälsa. Valet av LN att studera styrs av tillgänglighet och önskad modell, inguinal lymfkörtel har ett bra läge och lätt stöder studier av biologiskt relevanta modeller av hud och genitala slemhinnor infektion.
Inguinal LN, som alla LNS har ett omfattande mikrovaskulära nätverk förse den med blod. I allmänhet innebär detta mikrovaskulära nätverk de viktigaste fodret arteriole av LN som sedan grenar och flöden högt endotel venoler (HEV). HEV är specialiserade för att underlätta handel av immunceller till LN under både homeostas och infektion. Hur HEV reglerar människohandel till LN inom bägge dessa omständigheter är ett område med intensiv prospektering. LN foder arteriole har direkt uppströms inflytande på HEV och är den främsta tillgången på näringsämnen och cell rika blod i LN. Dessutom är förändringar i fodret arteriole inblandade i att underlätta induktion av adaptiva immunsvaret. LN mikrocirkulation har uppenbara betydelse för att upprätthålla en optimal blodtillförsel till LN och reglera immunceller tillströmning till LN, som är avgörande faktorer i rätt LN-funktion och därefter immunförsvaret.
Möjligheten att studera LN mikrocirkulation in vivo är nyckeln till att belysa hur immunsystemet och mikrocirkulation samspelar och påverkar varandra i LN. Här presenterar vi en metod för in vivo-avbildning av inguinal lymfkörtel. Vi fokuserar på avbildning av mikrocirkulation i LN, med särskilt beaktande av metoder som säkerställer att studera friska fartyg, förmågan att bibehålla avbildning av livskraftiga fartyg över ett antal timmar, och kvantifiering av fartygets storlek. Metoder för perfusion av mikrocirkulation med vasoaktiva läkemedel samt möjlighet att spåra och kvantifiera cellulära trafiken presenteras också.
Intravital mikroskopi av inguinal LN möjliggör direkt bedömning av mikrovaskulära funktionalitet och realtid gränssnittet i den direkta gränssnittet mellan immunceller, LN och mikrocirkulation. Denna teknik skulle kunna kombineras med många immunologiska tekniker och fluorescerande celler märkning samt manipuleras för att studera kärl av andra LNS.
Protocol
1. Reagensberedning
- Reagenser skall användas under hela försöksperioden bör förberedas innan det kirurgiska protokollet. Observera att alla lösningar har gjorts med steril teknik.
- Fysiologisk koksaltlösning (PSS) är bäst upprättats i två komponenter: basiskt salt lösning och natriumbikarbonatlösning. Bered båda lösningarna på 20X koncentration och förvara vid 4 ° C. Natriumbikarbonat på 20X är 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) och basiskt salt lösning vid 20X koncentration 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol) och 23,4 MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Lösningar bör beredas i dH 2 O och kemikalier bör läggas en i taget och rörs om tills lösningen är klar innan du lägger i nästa kemiska
- Förbered 2L av PSS genom att späda lika volymer av natriumbikarbonat och basiskt salt lösning och spädning till 1X koncentration (för två 2L av PSS späd 100 ml vardera natriumbikarbonat och grundläggande saltlösning i dH 2 O
- Placera 2L mätkolv som innehåller PSS och PSS i 37 ° C vattenbad. Jämvikt lösningen med 5% CO 2 / balans kvävgas för 1 timme före start av kirurgiska ingrepp.
- Vasoaktiva kemikalier (ex. fenylefrin, acetylkolin, natriumnitroprussid) är bäst förberedda på 1M koncentration i dH2O och lagras i 100μl alikvoter vid -20 ° C.
2. Animal Förberedelser
- Bestäm vikten på musen och administrera den initiala dosen av natrium pentobarbital på 90mg/kg efter intraperitoneal injektion. Under hela det förfarande musen övervakas kontinuerligt för anestesi planet via tå nypa och noggrann genomgång av andningsfrekvens. Ytterligare injektioner av natrium pentobarbital ska ges som behövs på 20mg/kg att upprätthålla anestesi plan. Den kirurgiska plan anestesi underhålls i enlighet med federala och institutionella regler som beskrivs i djurvård protokollet godkännas av Djurens skötsel och användning kommittén (ACUC) av University of Northern BC.
- Ta bort håret från buk-och flanken / höften, sladd osv. Avlägsna återstående lösa hår med kompress med alkohol och klappa området med tejp. Detta är tillräckligt eftersom detta experimentella förfarande terminalen.
- Placera musen på en tydlig kirurgiska styrelse i ryggläge och fäst musen till styrelsen genom att tejpa varje footpad till styrelsen. Kroppstemperatur upprätthålls via en extern värmelampa och övervakas via rektal termometer för att säkerställa att hypotermi inte uppstår som ett resultat av bedövningsmedel.
3. Kirurgiskt ingrepp
- Under hela operationen att utsättas vävnad alltid hålls superfused med jämvikt värmde PSS lösningen. Det är också viktigt att aldrig ta kontakt med kärlsystemet av intresse med kirurgiska instrument eller skada fartyg genom att lägga för mycket kraft på dem genom att manipulera fettvävnad och bindväv runt dem.
- Placera musen under dissekera omfattning. Gör en mittlinjen snitt längs ventrala yta bukhålan och dra i huden mot musens ryggraden.
- När huden är tillbaka så att LN är väl synliga, stift huden på en piedestal av genomskinliga Sylgard 184.
- Ta bort det tunna lagret av bindväv läggs över området runt LN
- Rensa överliggande fettvävnad och omger lymfkörtel tills mikrovaskulära sängen är utsatt för. De viktigaste arteriella segmentet lägger anslutning till LN och är allmänt overlayed av venule. Hela operationen tar cirka 30 minuter.
4. Imaging och fartyg Analys
- När fartyget segmentet av intresse är exponerad för under de dissekera omfattning, säkra preparatet på intravital mikroskop. Observera att djuret finns kvar på tydliga kirurgiska ombord medan den intravital mikroskop under hela experimentet. Kroppen temperaturen upprätthålls via värmelampa och mäts via rektal termometer som beskrivs under kirurgiska sektionen. Den anestesi planet är också övervakas under hela experimentet som beskrivs i avsnitt 2.1.
- Ställ in superfusion och linjer sug. Superfusion av PSS sker genom självtryck från en reservoar, i vattnet jacka uppvärmda reservoar (vattnet jacka cirkulerar och värms upp av den cirkulerande vattenbad) som perfusion med 5% CO 2 balanserad kväve och ner dropp linje med en hastighet av 10 ml / min. En sugledningen bör användas för att fortsätta dra superfused PSS bort från beredningen. Observera att innan experimentet sugledningar och vatten jacka grundligt rengörs och lagras efter varje försök. Detta säkerställer sterilitet före nästa experiment.
- Kontrollera temperaturen på superfusing PSS. Justera temperaturen påcirkulerande vatten bad och / eller graden av PSS superfusion att uppnå en temperatur på ~ 37 ° C över beredningen.
- Låt kärlsystem till jämvikt med PSS i minst 60 minuter och kvantifiera fartyget diameter med hjälp av video-oket. Normalt bör fartyget diameter bestämmas på flera punkter (till exempel vid 40, 50 och 60 minuter) för att säkerställa att fartyget har stabiliserats.
- Bedöma hälsa av fartyget med hjälp av ett glatt muskulatur specifik agonist (ex. fenylefrin, PE) och ett endotel specifika agonist (t.ex. acetylkolin, ACH). Koncentration av agonist bör justeras beroende på agonist, men för PE och Ach fartyget bör utvärderas vid varje koncentration genom kumulativ tillägg (10-5M till 10-9M) till superfusate. Varje agonist Ansökan ska separeras med en tvätt fas (normalt 30 minuter) med PSS tills fartyget återvänder till vila diameter.
- Efter utvärdering av fartygets hälsa, efterföljande vasoaktiva läkemedel, fluorescerande märkning, och cell spåra experiment kan genomföras.
- Efter försökets slut djuret ges en överdos av natrium pentobarbital. Djuret är sedan kontrolleras för att säkerställa att det inte finns något svar på tå nypa och brist på andningsorganen rörelse eller hjärtslag. Vid detta tillfälle detta följs av halsdislokation.
5. Representativa resultat:
Efter jämvikt under förberedelserna ska ge en tydlig bild som möjliggör identifiering av både arteriole och venule som levererar inguinal lymfkörtel. Det bör vara minimal fettceller kring fartyg för att möjliggöra väggar arteriole och venule att tydligt observeras för videon oken kan läggas ovanpå för att beräkna fartygets diameter. Den integrerade punkt för en lyckad förberedelse är arteriole har ett rikt utbud av blod rör sig genom lumen och att det finns en betydande grad av kärltonus (dvs. arteriole har förmågan att kärlsammandragning och vasodilate till glatt muskulatur och endotel specifika agonister respektive) .
Figur 1. Intravital mikroskopi bild av inguinal lymfkörtlar foder arteriole (röd pil) som matar lymfkörteln jämvikt med fysiologisk koksaltlösning och som går längs sidan den viktigaste venule (grön pil).
Figur 2. Normal vasoaktiva svar superfused fenylefrin (PE) med kumulativa förutom fysiologisk koksaltlösning utifrån koncentrationen 10 -9 Mkr till 10 -5 M. Närvaron av en robust vasokonstriktion antyder normala glatt muskulatur funktion som finns i arteriole.
Figur 3. Normalt vasoaktiva svar superfused acetylkolin (ACh) med kumulativa förutom fysiologisk koksaltlösning från koncentrationer 10 -9 Mkr till 10 -5 M. Närvaron av en robust vasodilatation är suggestiv av normal endotelfunktion närvarande i arteriole.
Discussion
Intravital mikroskopi av inguinal lymfkörtel som presenteras här ger möjlighet att bilden mikrocirkulation av lymfkörteln in-vivo. Därför underlättar det en form av direkt, i realtid observation. Imaging av LN mikrocirkulation är en unik webbplats som tillåter en att studera samspelet mellan immunförsvaret och kärlsystemet. Med hjälp av denna beredning kan fokus riktas specifikt på immunförsvaret, förändringar i kärlsystemet, eller på interaktion mellan de två.
Som med alla experimentella metoder, har standard intravital mikroskopi både fördelar och begränsningar. Standard IVM, såsom utarbetande beskrivs här, kan lätt ändras, och har tidigare visat av författarna för att epifluorescent mikroskopi genom införande av fluorescerande spårämne färgämnen eller märks populationer cell. Även om vanliga IVM inte ger möjlighet till tredimensionell avbildning och spårning som skulle ges av två-photon mikroskopi eller angiografi, är cell tracking fortfarande uppnås i två dimensioner så att cell-till-cell och cell-till-kärlsystemet samverkan ska observeras och kvantifieras och i samband med in-vivo administrering och efterföljande färgning med fluorescerande antikroppar kan användas för att ge data om protein / markör uttryck i realtid.
Särskilt alternativ avbildningstekniker kräver en statisk miljö för bilder; fastspänning av kirurgiska området eller tillägg av ett täckglas på en plan förberedelse är ofta behövs. Detta begränsar, om inte eliminerar, förmågan att aktivt BEGJUTA vaskulär eller andra mediatorer under förberedelserna för att utvärdera vaskulär integritet och fysiologi etc. eller användning av andra tekniker som bedrivs vasodilatation experiment inom IVM beredning. Dessutom kräver standarden IVM inte en helt platt beredning och påverkas inte av rörelse, såsom den som genereras av andningen av djuret. Detta gör att standard IVM att användas i större kirurgiska områden med större reproducerbarhet. Detta exemplifieras av inguinal lymfkörtel förberedelse beskrivs här. Med tanke på storleken och formen på lymfkörtel, kan preparatet inte göras platt utan att skada vävnaden och placeringen av noden ger upphov till betydande rörelse hänsyn till djurens andning. Sådana frågor skulle vara svåra att övervinna med andra metoder, men kan lätt behandlas med användning av standarden IVM beredningen beskrivits.
Sammanfattningsvis kan beredningen beskrivs ovan kombineras med någon rad andra biokemiska, kärl, och / eller immunologiska metoder såsom överlåtelse av delmängder av aktiverade eller märkta celler, induktion av hypoxi, och över-uttryck för utarmning av vaskulära medlare. Men ytterligare program är beroende av hälsan för den första behandlingen. Därför är det viktigt att alltid testa hälsa kärlsystemet som avbildas och utvärderas. Viktiga poäng för att uppnå en hälso-beredning är att säkerställa förberedelserna ständigt perfusion med jämvikt PSS vid kroppstemperatur och minimera kontakten och stress placeras på operationsområdet under operationen.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av den kanadensiska Institutes of Health Research, kanadensiska institutet för innovation, University of British Columbia Centrum för Blood forskning och University of Northern BC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
