Summary
Inguinal lenf nodu (LN) intravital mikroskopi gerçekleştirmek için bir teknik özetlenmiştir. Böyle bir tekniği, gerçek zamanlı sağlar.
Abstract
Vücutta bulunan lenf düğümleri (LN), bağışıklık sisteminin bir parçasıdır. Bu nedenle, adaptif bağışıklık yanıtının indüksiyonu için bir site olarak hizmet ve efektör hücrelerinin gelişimi. Bu nedenle, LN, işgalci patojenlere mücadele ve sağlığı korumak için kilit öneme sahiptir. Erişilebilirlik ve istenilen model LN çalışmaya seçimi dikte kasık lenf düğümü yer alır ve kolayca biyolojik ilgili modelleri, cilt ve genital mukoza enfeksiyon çalışmaları destekler.
Inguinal LN LN gibi kan ile besleyen geniş bir mikrovasküler ağına sahiptir. Genel olarak, bu mikrovasküler ağ, yüksek endotelyal venüller (HEVs) beslemelerini daha sonra şube ve LN ana besleme arteriyol içerir. HEVs homeostazı ve enfeksiyon sırasında bağışıklık hücrelerinin LN ticareti kolaylaştırmak için uzmanlaşmıştır. HEVs Bu koşullar altında LN ticareti düzenleyen Nasıl bir alanda yoğun bir keşif. LN linki arteriyol, üzerinde doğrudan HEVs upstream etkisi vardır ve içine besin ve hücre açısından zengin kan LN ana kaynağı. Ayrıca, yem arteriyol değişiklikleri adaptif bağışıklık yanıtının indüksiyonu kolaylaştırmak sorumlu tutulmaktadır. LN mikrodolaşımını LN optimal kan kaynağının korunması ve uygun LN fonksiyonu ve daha sonra bağışıklık yanıtının önemli unsurlardır LN, bağışıklık hücre akını düzenleyen açık bir öneme sahiptir.
In vivo LN mikrodolaşımını çalışma yeteneği, bağışıklık sistemi ve mikrovasküler etkileşim ve LN içinde bir başka etkisi nasıl nedenlerine açıklık anahtar . Burada, kasık lenf nodu in vivo görüntüleme için bir yöntem mevcut. Biz, sağlıklı çalışma gemilerin, birkaç saat boyunca canlı damarlarının görüntülenmesinde korumak için yeteneği ve geminin büyüklüğü ölçümü sağlamak yöntemlerine özel önem vererek, LN mikrovaskuleterini görüntüleme odaklanır. Vazoaktif ilaçlar ile mikrovasküler perfüzyon gibi hücresel trafiğini izlemek ve ölçmek için potansiyel yöntemleri de sunulmaktadır.
Inguinal LN intravital mikroskopi mikrovasküler işlevsellik ve bağışıklık hücreleri, LN, mikrosirkülasyon arasında doğrudan bir arayüz, gerçek zamanlı arayüzü doğrudan değerlendirme sağlar. Bu teknik potansiyel birçok immünolojik teknikler ve yanı sıra diğer LN damarsal çalışma manipüle floresan hücre etiketleme ile kombine edilebilir.
Protocol
1. Reaktif Hazırlama
- Deney boyunca kullanılacak Reaktifler cerrahi protokolü başlamadan önce hazırlanmalıdır. Tüm çözümler, steril tekniği kullanılarak yapıldı.
- Serum fizyolojik solüsyonu (PSS) en iyi iki bileşenden hazırlanır: temel tuz solüsyonu ve sodyum bikarbonat çözeltisi. 20X konsantrasyon ve mağaza 4 ° C hem de çözümleri hazırlayın 20X az sodyum bikarbonat 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) ve 20X konsantrasyonu temel tuz çözeltisi 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol) ve 23,4 MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Çözüm sonraki kimyasal ekleyerek önce netleşene kadar Çözümler, bir defada bir eklenmelidir dH 2 O ve kimyasallar hazırlanır ve karıştırılır olmalıdır
- Sodyum bikarbonat ve temel tuz çözeltisi eşit hacimlerde seyreltilmesi ve konsantrasyonu 1X (dH 2 O her sodyum bikarbonat ve temel tuz çözeltisi iki PSS 2L seyreltik 100 ml için seyreltilmesi PSS 2L hazırlayın
- Yeri 2L ölçülü balona PSS ve PSS içeren 37 ° C su banyosu. Cerrahi işlem başlatmak için önce 1hr için 5% CO 2 / denge azot gazı ile çözüm dengelenmesi.
- Vazoaktif kimyasallar (örneğin Fenilefrin, asetilkolin, sodyum nitroprussid) -20 ° C'de dH2O 1M konsantrasyonu en iyi hazırlanmış ve 100μl alikotları depolanan
2. Hayvan Hazırlık
- Farenin ağırlığını belirlemek ve intraperitoneal 90mg/kg pentobarbital sodyum başlangıç dozu yönetmek. Prosedürü boyunca fare anestezi uçak için, ayak tutam ve solunum hızı dikkatli muayenesi ile sürekli izlenir. Pentobarbital sodyum Ek enjeksiyonları 20mg/kg anestezi düzlemde korumak için gerektiği şekilde uygulanmalıdır. Kuzey M.Ö. Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından onaylanan hayvan bakımı protokolde belirtildiği gibi anestezi cerrahi düzlemine federal ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak korunur.
- Saç tıraş makinesi ile karın ve böğür / kalça bölgesi çıkarın. Alkollü bez gevşek saç kalan alan ve bant ile okşamaya çıkarın. Bu deneysel işlem terminali olarak yeterlidir.
- Yatar pozisyonda net bir cerrahi kurulu fare yerleştirin ve yönetim kurulu her Kapkaççı taping kuruluna fare takmak. Vücut sıcaklığı, harici bir ısı lambası ile korunur ve bu hipotermi anestezik bir sonucu olarak ortaya çıkmaz sağlamak için rektal termometre ile takip edilir.
3. Cerrahi Prosedür
- Tüm cerrahi işlem sırasında maruz kalan doku dengelenmiş ısıtılmış PSS çözümü ile her zaman superfused tutulur emin olun. Çevrelerindeki yağ dokusu ve bağ dokusu manipüle ederek onlara çok kuvvet koyarak ilgi damar cerrahi aletler ile temas veya damarlarının zarar hiç de önemlidir.
- Diseksiyon kapsamında fare yerleştirin. Karın boşluğunun ventral orta hat boyunca bir kesi yapın ve farenin spinal kolon doğru cilt geri çekin.
- LN deride kolaylıkla görülebilir, böylece geri çekilene sonra, şeffaf Sylgard 184 bir kaide üzerine cilt pin.
- LN çevresindeki alan kaplanacağı bağ dokusu ince bir tabaka çıkarın
- Adipoz doku kaplanacağı temizleyin ve mikrovasküler yatakta maruz kadar lenf nodu çevreleyen. Ana arter segment LN bitişik bırakır ve yaygın venule tarafından yerleştirilmiştir. Tüm cerrahi, yaklaşık 30 dakika sürer.
4. Görüntüleme ve Damar Analizi
- Diseksiyon kapsamında ilgi damar segment ortaya çıktığında, intravital mikroskop hazırlık güvenli. Hayvan deney süresi boyunca intravital mikroskop sırasında açık cerrahi gemide kaldığını unutmayın. Cerrahi bölümünde sırasında açıklandığı gibi, vücut ısısı, ısı lambası ile korunur ve rektal termometre ile ölçülür. Bölüm 2.1 'de anlatıldığı gibi anestezi düzlemde de deney boyunca izlenir.
- Superfusion ve emiş hatları ayarlayın. PSS Superfusion% 5 CO 2 dengeli azot ile perfüze olan su ceketi ısıtmalı rezervuar (su ceketi dolaşan su banyosunda dolaşan ve ısıtmalı), 10ml bir oranında bir damla satır aşağı, bir rezervuar gravite besleme ile gerçekleşir / dak. Emiş hattı, hazırlık uzak superfused PSS çekin devam etmek için kullanılmalıdır. Not deney emiş hatları ve su ceketi önce iyice temizlenmeli ve her bir deney sonrası saklanan. Bu sonraki deneyde önce sterilite sağlar.
- Superfusing PSS sıcaklığını kontrol edin. Sıcaklığı ayarlayın~ 37 ° C hazırlık çapında bir sıcaklık elde etmek için su banyosu ve / veya PSS superfusion oranı dolaşan.
- Damarsal en az 60 dakika süreyle PSS ile dengelenmesi ve video kumpas kullanarak damar çapı ölçmek için izin verin. Tipik olarak, damar çapı, damar stabilize sağlamak için (örneğin, 40, 50, ve 60 dakika) birden fazla noktada tespit edilmelidir.
- Damar düz kas spesifik agonist (örn. Fenilefrin, PE) ve endotel spesifik agonist (örneğin asetilkolin, ACh) kullanarak sağlık değerlendirin. Agonist konsantrasyonu agonist bağlı olarak ayarlanabilir olmalıdır, ancak PE ve Ach gemi superfusate (10 9A 10-5M) kümülatif Ayrıca her konsantrasyonda değerlendirilmelidir. Her agonisti uygulaması gemi dinlenme çapı dönene kadar PSS kullanılarak yıkama aşamasında (genellikle 30 dakika) ayrılmalıdır.
- Gemi sağlık izleme deneyler, sonraki vazoaktif ilaçlar, floresan etiketleme ve hücre aşağıdaki değerlendirme yapılabilir.
- Deneyin sonunda hayvan pentobarbital sodyum aşırı dozda verilir. Hayvan, sonra ayak tutam ve kalp atışı, solunum hareketi veya olmaması için hiçbir yanıt var olduğundan emin olmak için takip edilmektedir. Böyle bir zamanda bu servikal dislokasyon tarafından takip edilmektedir.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Dengelenme döneminin ardından hazırlık, arteriol ve kasık lenf nodu sağlayan venule hem belirlenmesi için izin veren bir net bir görüntü elde edilmelidir. Minimum yağ hücreleri arteriol ve damar çapını hesaplamak için üst üste video kaliperler için açıkça gözlenebilir venule duvarları olanak sağlamak için damarları çevreleyen olmamalıdır. Başarılı bir hazırlık ayrılmaz noktası arteriyol lümen yoluyla ve vasküler sesi önemli ölçüde (yani arteriyol vasoconstrict ve sırasıyla düz kas ve endotel özel agonistleri vasodilate yeteneğine sahiptir) olduğunu hareket kan zengin bir ürün yelpazesine sahiptir. .
Şekil 1, lenf nodu, fizyolojik tuzlu su solüsyonu ve yan boyunca ana venule (yeşil ok) çalıştıran ile dengelenmiş beslenme kasık lenf nodu besleme arteriyol (kırmızı ok) intravital mikroskopi görüntü.
Şekil 2 kümülatif Ayrıca serum fizyolojik konsantrasyonları superfused fenilefrin (PE) Normal vazoaktif yanıt 10 -9 M 10 M. -5 Sağlam bir vazokonstriksiyon varlığı arteriyol normal düz kas fonksiyonu düşündüren.
Şekil 3 konsantrasyonları serum fizyolojik kümülatif Ayrıca superfused asetilkolin (Ach) Normal vazoaktif yanıt 10 -9 M 10 M. -5 Sağlam bir vazodilatasyon arteriyol normal endotelyal fonksiyon mevcut varlığını düşündürür.
Discussion
Burada sunulan inguinal lenf nodu intravital mikroskopi lenf nodu in vivo görüntü mikrodolaşımını yeteneği sağlar. Bu nedenle, doğrudan, gerçek zamanlı gözlem aracı kolaylaştırır. LN mikrodolaşımını Görüntüleme bir immün yanıt ve damarsal arasındaki arayüz çalışma sağlayan benzersiz bir site. Bu preparatın kullanarak, bağışıklık yanıtı, damarsal değişiklikler, ya da ikisi arasındaki etkileşimi odak özellikle yönlendirilmiş olabilir.
Tüm deneysel yaklaşımlar olduğu gibi, standart intravital mikroskopi hem avantajları ve sınırlamaları vardır. Hazırlanması burada açıklandığı gibi Standart IVM, kolayca değiştirilebilir, ve daha önce, tanıtım veya floresan tracer boyalar etiketli hücre popülasyonlarının üzerinden epifluorescent mikroskobu izin yazarlar tarafından ortaya konmuştur. Standart IVM, üç boyutlu görüntüleme olanağı vermek ve iki foton mikroskopi veya anjiyografi ile verilecekti gibi izleme rağmen, hücre izleme hücre-hücre ve hücre-vasküler bir etkileşim olmasını sağlayan iki boyutlu olarak elde edilir gözlenen ve rakamsal ve floresan antikorlar in vivo yönetimi ve daha sonraki boyama ile birlikte, gerçek zamanlı olarak protein / işaretleyici ifade veri vermek için kullanılabilir .
Özellikle, görüntüler için alternatif görüntüleme teknikleri statik bir ortam gerektirir; sık cerrahi alan veya düz bir hazırlık lamel ek sıkma tabi. Bu sınırlar, değilse aktif vasküler bütünlüğü ve fizyoloji vb veya IVM hazırlığı içinde yapılan vazodilatasyon deneyleri gibi diğer tekniklerin kullanımı değerlendirmek için hazırlık içinde vasküler veya diğer mediyatörler serpmek yeteneği ortadan kaldırır. Ayrıca, standart IVM tamamen düz bir hazırlık gerektirmez ve hayvanın nefes tarafından oluşturulan gibi hareket etkilenmez. Bu standart IVM büyük tekrarlanabilirlik ile daha fazla cerrahi alanlarda kullanılmasına izin verir. Bu, burada açıklanan kasık lenf nodu hazırlık örneklediği. Lenf nodu boyutu ve şekli göz önüne alındığında, hazırlık dokuya zarar vermeden düz yapılabilir edemez ve düğümün konumu nedeniyle önemli bir hareket hayvan solunum yol açmaktadır. Bu tür konularda diğer yöntemlerle üstesinden gelmek için zor olacağını, ancak açıklanan standart IVM hazırlık ile kolayca dağıtılır.
Özet olarak, yukarıda ayrıntılı olarak hazırlanması, herhangi bir sayı ile kombine edilebilir diğer biyokimyasal, vasküler ve / veya aktive altkümelerini transferi veya etiketli hücreleri, hipoksi indüksiyonu ve vasküler arabulucular tükenmesi üzerinde ifade gibi immünolojik teknikleri. Ancak, ek uygulamalar ilk hazırlık sağlık bağlıdır. Bu nedenle, her zaman görüntülü ve değerlendirilmektedir damar sağlığını test etmek için hayati önem taşımaktadır. Bir sağlık hazırlığı ulaşmak için kilit noktaları hazırlanması sürekli vücut ısısı dengelenmiş PSS ile perfüze ve ameliyat sırasında cerrahi alana yerleştirilen temas ve stresi en aza indirerek sağlamak.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri, Kanada, British Columbia Merkezi Üniversitesi İnovasyon, Kan Araştırma ve Kuzey M.Ö. Üniversitesi Vakfı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
