Summary
Een techniek voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de lies lymfeklier (LN) is geschetst. Een dergelijke techniek maakt het mogelijk voor real-time,
Abstract
Lymfeklieren (LN's), verspreid over het lichaam, zijn een integraal onderdeel van het immuunsysteem. Ze dienen als een site voor inductie van adaptieve immuunrespons en dus de ontwikkeling van effector cellen. Als zodanig, LNS zijn de sleutel tot de bestrijding van binnendringende ziekteverwekkers en behoud van gezondheid. De keuze van LN om te studeren wordt bepaald door de bereikbaarheid en het gewenste model, de inguinale lymfeklier is goed gelegen en gemakkelijk ondersteunt studies van biologische relevante modellen van de huid en slijmvliezen genitale infectie.
De lies LN, net als alle LNS, beschikt over een uitgebreid netwerk van microvasculaire het leveren van het met bloed. In het algemeen is dit microvasculaire netwerk omvat de belangrijkste voedermiddelen arteriole van de LN die vervolgens takken en voedt hoog endotheliale venulen (HEV). HEV's zijn gespecialiseerd voor het vergemakkelijken van de handel van de immuuncellen in de LN tijdens zowel homeostase en infectie. Hoe HEV handel te reguleren in de LN onder beide omstandigheden is een gebied van intense exploratie. De LN-feed arteriole, heeft directe invloed op de stroomopwaarts HEV's en is de belangrijkste toevoer van voedingsstoffen en cel-rijke bloed in de LN. Verder worden veranderingen in het voer arteriole betrokken bij het faciliteren van inductie van adaptieve immuunrespons. De LN microvasculatuur heeft duidelijk belang bij het handhaven van een optimale bloedtoevoer naar de LN en reguleren immuuncellen instroom in de LN, die zijn cruciale elementen in de juiste functie LN en vervolgens immuunrespons.
De mogelijkheid om de LN microvasculatuur in-vivo-studie is de sleutel tot het ophelderen hoe het immuunsysteem en de microvasculatuur op elkaar inwerken en elkaar beïnvloeden in het LN. Hier presenteren we een methode voor in vivo beeldvorming van de lies lymfeklier. Wij richten ons op beeldvorming van de microvasculatuur van de LN, met bijzondere aandacht voor methoden die de studie van gezonde vaten, de mogelijkheid om beeldvorming van levensvatbare schepen te behouden gedurende een aantal uren, en kwantificering van het schip grootte te verzekeren. Methoden voor perfusie van de microvasculatuur met vasoactieve geneesmiddelen, alsmede de mogelijkheden op te sporen en te kwantificeren cellulaire verkeer worden ook gepresenteerd.
Intravitale microscopie van de lies LN maakt een directe beoordeling van microvasculaire functionaliteit en real-time interface van de directe interface tussen de immuuncellen, de LN, en de microcirculatie. Deze techniek potentieel om te worden gecombineerd met de vele immunologische technieken en fluorescerende cel etikettering, alsmede gemanipuleerd om vaatstelsel van andere LNS studie.
Protocol
1. Bereiding van het reagens
- Reagentia worden gebruikt in het experiment moet worden voorbereid voordat de chirurgische protocol. Merk op dat alle oplossingen werden gemaakt met behulp van steriele techniek.
- Fysiologische zoutoplossing (PSS) is best bereid in twee componenten: basisch zout-oplossing en natriumbicarbonaat-oplossing. Bereid oplossingen op 20X concentratie en bewaren bij 4 ° C. Natriumbicarbonaat bij 20X is 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) en basisch zout oplossing 20X concentratie 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), en 23.4mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Oplossingen moeten worden opgesteld in dH 2 O en chemicaliën moeten worden toegevoegd een voor een en geroerd tot de oplossing helder is voorafgaand aan het toevoegen van de volgende chemische
- Bereid 2L van de PSS door het verdunnen van gelijke volumes van natriumbicarbonaat en basisch zout oplossing en verdunnen tot 1X concentratie (voor twee 2L van PSS 100 ml verdunnen van elk natriumbicarbonaat en basisch zout oplossing in dH 2 O
- Plaats 2L maatkolf met PSS en PSS in 37 ° C waterbad. Evenwicht van de oplossing met 5% CO 2 / balans stikstofgas voor 1 uur voorafgaand aan de start van de chirurgische procedure.
- Vasoactive chemicaliën (ex. fenylefrine, acetylcholine, natrium nitroprusside) zijn het best voorbereid op 1M concentratie in dH2O en opgeslagen in 100μl fracties bij -20 ° C.
2. Dier Voorbereiding
- Bepaal het gewicht van de muis en het beheer van de initiële dosis van natriumpentobarbital op 90mg/kg door intraperitoneale injectie. Tijdens de gehele procedure van de muis is voortdurend in de gaten voor anesthesie vliegtuig via teen knijpen en een zorgvuldige bestudering van de ademfrequentie. Extra injecties van natriumpentobarbital moet worden toegediend als nodig op 20mg/kg om de anesthesie vliegtuig te behouden. De chirurgische vlak van anesthesie wordt onderhouden in overeenstemming met federale en institutionele regelingen zoals beschreven in het dier zorg protocol goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Committee (ACUC) van de Universiteit van Noord-BC.
- Verwijder het haar van de buik-en flank / hip gebied door scheerapparaat. Verwijder de resterende losse haren door alcoholdoekje en klopte het gebied met tape. Dit is voldoende als deze experimentele procedure is terminal.
- Plaats de muis op een duidelijke chirurgische bord in een liggende positie en bevestig de muis aan de raad door de tape elke voetzool aan de raad. De lichaamstemperatuur wordt onderhouden via een externe warmte-lamp en gecontroleerd via de rectale thermometer om ervoor te zorgen dat de onderkoeling niet optreden als gevolg van de narcose.
3. Chirurgische Procedure
- Gedurende de gehele chirurgische procedure te garanderen blootgestelde weefsel wordt altijd gehouden superfused met evenwicht warme PSS oplossing. Het is ook belangrijk om nooit contact te maken met het vaatstelsel van belang met chirurgische instrumenten of de bloedvaten beschadigen door het plaatsen van te veel kracht op hen door het manipuleren van vetweefsel en bindweefsel om hen heen.
- Plaats de muis onder het ontleden scope. Maak een middellijn incisie langs het ventrale oppervlak van de buikholte en trekken de huid naar de wervelkolom van de muis de kolom.
- Nadat de huid is zo teruggetrokken dat de LN is goed zichtbaar, pin van de huid op een sokkel van transparant Sylgard 184.
- Verwijder het dunne laagje bindweefsel bedekken het gebied rond de LN
- Schakel het vetweefsel overlappend en omringen de lymfeklier totdat de microvasculaire bed is blootgesteld. De belangrijkste arteriële segment ligt grenzend aan de LN en wordt vaak overlayed door de venule. De hele ingreep duurt ongeveer 30 minuten.
4. Imaging en Vessel Analyse
- Zodra het schip segment van belang is blootgesteld, onder het ontleden scope, veilig de voorbereiding op de intravitale microscoop. Merk op dat dierlijke resten op de duidelijke chirurgische boord, terwijl op de intravitale microscoop tijdens de gehele duur van het experiment. De lichaamstemperatuur wordt onderhouden via warmtelamp en gemeten via de rectale thermometer, zoals beschreven tijdens de chirurgische afdeling. De verdoving vliegtuig wordt ook gecontroleerd door het experiment zoals beschreven in paragraaf 2.1.
- Stel de superfusie en zuigleiding. Superfusie van PSS plaatsvindt door de zwaartekracht-feed van een reservoir, in de watermantel verwarmde reservoir (het water jas is verspreid en verwarmd door de circulerende waterbad) worden doorbloed met 5% CO 2 evenwichtig stikstof, en naar beneden een infuus lijn met een snelheid van 10 ml / min. Een zuigleiding moet worden gebruikt om verder te gaan weg te trekken superfused PSS uit de voorbereiding. Merk op dat voorafgaand aan het experiment de zuig-lijnen en watermantel grondig worden gereinigd en opgeslagen na elk experiment. Dit zorgt voor steriliteit voorafgaand aan de volgende experiment.
- Controleer de temperatuur van de superfusing PSS. Stel de temperatuur van decirculerende water bad en / of de snelheid van PSS superfusie tot een temperatuur van ~ 37 ° C te bereiken over de voorbereiding.
- Laat de vasculatuur met PSS equilibreren voor ten minste 60 minuten en het schip diameter met behulp van de video remklauw kwantificeren. Normaal gesproken moet een diameter van schip worden bepaald op meerdere punten (bijvoorbeeld op 40, 50, en 60 minuten) om ervoor te zorgen het schip gestabiliseerd.
- Beoordelen van de gezondheid van het schip met behulp van een gladde spieren specifieke agonist (ex. fenylefrine, PE) en een endotheel specifieke agonist (bijv. acetylcholine, ACh). Concentratie van agonist moet worden aangepast, afhankelijk van de agonist, maar voor PE en Ach het schip moeten worden geëvalueerd op elke concentratie door de cumulatieve toevoeging (10-5M tot 10-9M) naar de superfusate. Elke agonist aanvraag moet worden gescheiden door een wash-fase (meestal 30 minuten) met behulp van PSS tot het vaartuig weer op rust diameter.
- Na evaluatie van het schip de gezondheid, de latere vasoactieve geneesmiddelen, TL-etikettering, en cel tracing experimenten kunnen worden uitgevoerd.
- Na het einde van het experiment het dier krijgt een overdosis natriumpentobarbital. Het dier wordt vervolgens gecontroleerd om ervoor te zorgen dat er geen reactie tot teen knijpen en het ontbreken van respiratoire beweging of hartslag. Op het moment dat wordt gevolgd door cervicale dislocatie.
5. Representatieve resultaten:
Na de periode van de voorbereiding evenwicht moet opleveren een duidelijk beeld die het mogelijk maakt voor de identificatie van zowel de arteriole en venule dat de inguinale lymfeklier supplies. Er moeten minimaal vetcellen rond de schepen toe te staan voor wanden van de arteriole en venule duidelijk worden waargenomen voor de video-remklauwen te worden gesuperponeerd om vat diameter te berekenen. De integrale punt van een succesvolle voorbereiding is de arteriole heeft een rijk aanbod van bloed zich door het lumen en dat er een grote mate van vasculaire tonus (dwz de arteriole heeft de mogelijkheid om vernauwt en vasodilate tot spier-en endotheel specifieke agonisten respectievelijk glad) .
Figuur 1. Intravitale microscopie beeld van de inguinale lymfeklier-feed arteriole (rode pijl) het voeden van de lymfeklier in evenwicht gebracht met fysiologische zoutoplossing en langs de kant van de belangrijkste venule (groene pijl).
Figuur 2. Normal vasoactieve reactie op superfused fenylefrine (PE) met cumulatieve Naast de fysiologische zoutoplossing door de concentraties 10 -9 M tot 10 -5 M. De aanwezigheid van een robuuste vasoconstrictie is suggestief voor een normale gladde spierfunctie in de arteriole.
Figuur 3. Normale vasoactieve reactie op superfused acetylcholine (ACh) door cumulatieve Naast de fysiologische zoutoplossing van concentraties 10 -9 M tot 10 -5 M. De aanwezigheid van een robuuste vasodilatatie is suggestief voor een normale endotheelfunctie in de arteriole.
Discussion
Intravitale microscopie van de lies lymfeklier hier gepresenteerde biedt de mogelijkheid om de afbeelding microvasculatuur van de lymfeklier in-vivo. Zo, het vergemakkelijkt een middel om directe, real-time observatie. Beeldvorming van de LN microvasculatuur is een unieke site die het mogelijk maakt een het bestuderen van de interface tussen de immuunrespons en het vaatstelsel. Met behulp van deze voorbereiding, kan richten zich specifiek gericht zijn op de immuunrespons, veranderingen in het vaatstelsel, of op interactie tussen de twee.
Zoals met alle experimentele benaderingen, standaard intravitale microscopie heeft zowel voordelen en beperkingen. Standaard IVM, zoals de voorbereiding hier beschreven, kan eenvoudig worden aangepast, en is al eerder aangetoond door de auteurs epifluorescerende microscopie mogelijk door de invoering van fluorescerende tracer kleurstoffen of geëtiketteerd celpopulaties. Hoewel standaard IVM geeft niet de mogelijkheid van driedimensionale beeldvorming en het traceren, zoals zou worden gegeven door twee-foton microscopie of angiografie, is cell tracking nog steeds bereikt in twee dimensies waardoor cel-tot-cel en cel-tot-vaatstelsel interactie te waargenomen en gekwantificeerd en in combinatie met in-vivo toediening en de daaropvolgende kleuring met fluorescerende antilichamen kunnen worden gebruikt om gegevens over eiwit / marker expressie in real-time te geven.
Met name, alternatieve beeldvormende technieken vereisen een statische omgeving voor afbeeldingen, klemmen van de chirurgische gebied of de toevoeging van een dekglaasje op een platte voorbereiding is vaak nodig. Dit beperkt, zo niet elimineert, de mogelijkheid om actief te vasculaire of andere bemiddelaars perfuseren over de voorbereiding op vasculaire integriteit en fysiologie, etc. of het gebruik van andere technieken, zoals uitgevoerd vaatverwijding proeven in de IVM voorbereiding te evalueren. Bovendien is standaard IVM niet nodig een volledig vlakke voorbereiding en wordt niet beïnvloed door beweging, zoals die gegenereerd door de ademhaling van het dier. Dit maakt standaard IVM worden gebruikt in meer chirurgische gebieden met een grotere reproduceerbaarheid. Dit wordt geïllustreerd door de lies lymfeklier voorbereiding hier beschreven. Gezien de grootte en vorm van de lymfeklieren, kan de bereiding niet worden gemaakt vlak zonder verwonden het weefsel en de locatie van het knooppunt leidt tot aanzienlijke beweging als gevolg van dierlijke ademhaling. Dergelijke kwesties zou moeilijk te overwinnen door andere methoden, maar zijn gemakkelijk te ondervangen met behulp van de standaard beschreven IVM voorbereiding.
Samengevat, kan de bereiding hierboven beschreven worden gecombineerd met een aantal andere biochemische, vasculaire en / of immunologische technieken, zoals de overdracht van subsets van geactiveerde of gelabelde cellen, inductie van hypoxie, en over-expressie van uitputting van de vasculaire mediators. Echter, aanvullende toepassingen zijn afhankelijk van de gezondheid van de eerste voorbereidingen. Daarom is het van belang om altijd te testen van de gezondheid van de bloedvaten in beeld wordt gebracht en geëvalueerd. Belangrijke punten voor het bereiken van een gezondheids-preparaat het waarborgen van de voorbereiding is voortdurend geperfuseerd met evenwicht PSS op lichaamstemperatuur en het minimaliseren van contact en stress op de chirurgische gebied tijdens de operatie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door de Canadese Institutes of Health Research, de Canadese Stichting voor Innovatie, Universiteit van British Columbia Centrum voor Blood onderzoek en de Universiteit van Noord-BC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
