Summary
Una tecnica per l'esecuzione di microscopia intravitale del linfonodo inguinale (LN) è delineato. Tale tecnica permette in tempo reale,
Abstract
Linfonodi (LN), situato in tutto il corpo, sono parte integrante del sistema immunitario. Essi servono come sito per l'induzione della risposta immunitaria adattativa e, quindi, lo sviluppo delle cellule effettrici. Come tale, LNs sono la chiave per combattere i patogeni invasori e mantenere la salute. La scelta della LN di studio è dettata dalla accessibilità e il modello desiderato; del linfonodo inguinale è ben posizionato e supporta facilmente gli studi di modelli biologicamente rilevanti della pelle e della mucosa genitale infezione.
La LN inguinale, come tutti i LNS, ha una vasta rete microvascolare fornirla di sangue. In generale, questa rete microvascolare include il arteriola principale di alimentazione della LN che successivamente i rami e si nutre di alta venule endoteliali (HEV). HEV sono specializzati per facilitare il traffico delle cellule immunitarie nel LN sia durante l'omeostasi e infezioni. Come HEV regolare il traffico in LN sotto entrambe queste circostanze, è una zona di esplorazione intenso. La LN alimentazione arteriola, ha influenza diretta sul monte HEV ed è l'alimentazione principale di sostanze nutritive e cellule del sangue ricco in LN. Inoltre, i cambiamenti nel arteriola mangimi sono implicati nel facilitare l'induzione di risposta immunitaria adattativa. Il microcircolo LN è evidente importanza nel mantenimento di un ottimale apporto di sangue al LN e regolare afflusso delle cellule immunitarie nel LN, che sono elementi cruciali in funzione LN corretta e la risposta immunitaria in seguito.
La possibilità di studiare il microcircolo LN in vivo è la chiave per chiarire come il sistema immunitario e il microcircolo interagiscono e si influenzano l'un l'altro all'interno della LN. Qui, vi presentiamo un metodo per imaging in vivo del linfonodo inguinale. Ci concentriamo su immagini del microcircolo della LN, prestando particolare attenzione ai metodi che assicurano lo studio dei vasi sani, la capacità di mantenere l'imaging dei vasi vitali per un certo numero di ore, e la quantificazione di grandezza delle navi. Metodi per la perfusione del microcircolo con farmaci vasoattivi come pure la possibilità di rintracciare e quantificare il traffico cellulare sono anche presentato.
Microscopia intravitale della LN inguinale consente una valutazione diretta della funzionalità microvascolare e in tempo reale, interfaccia di interfaccia diretta tra cellule del sistema immunitario, la LN, e la microcircolazione. Questa tecnica potenziale per essere combinata con tecniche immunologiche molti ed etichettatura delle cellule fluorescenti e manipolati per lo studio della vascolarizzazione LNs altri.
Protocol
1. Preparazione dei reagenti
- Reagenti da utilizzare in tutta l'esperimento deve essere preparato prima di iniziare il protocollo chirurgico. Si noti che tutte le soluzioni sono state effettuate utilizzando una tecnica sterile.
- Soluzione fisiologica salina (PSS) è meglio preparato in due componenti: la soluzione di base sale e bicarbonato di sodio. Preparare entrambe le soluzioni a concentrazione 20X e conservare a 4 ° C. Bicarbonato di sodio a 20X è 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) e soluzione salina di base a 20X concentrazione è 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), e 23,4 mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Le soluzioni devono essere preparate in dH 2 O e sostanze chimiche devono essere aggiunti uno alla volta e mescolate fino a quando la soluzione è chiara prima di aggiungere il successivo chimica
- Preparare 2L di PSS diluendo volumi uguali di bicarbonato di sodio e di soluzione salina di base e diluito a concentrazione 1X (per due 2L di PSS diluire 100 ml di ogni soluzione di bicarbonato di sodio e sali di base in dH 2 O
- Luogo matraccio 2L contenente PSS e PSS in acqua a 37 ° C bagno. Equilibrare la soluzione con il 5% di CO 2 / gas azoto equilibrio per 1 ora prima dell'inizio della procedura chirurgica.
- Prodotti chimici vasoattivi (es. fenilefrina, l'acetilcolina, nitroprussiato di sodio) sono meglio preparati a concentrazione 1M in dH2O e conservati in 100μl aliquote a -20 ° C.
2. Preparazione degli animali
- Determinare il peso del mouse e somministrare la dose iniziale di sodio pentobarbital a 90mg/kg mediante iniezione intraperitoneale. Nel corso della procedura il mouse è continuamente monitorato per il piano di anestesia attraverso pizzico punta e attento esame della frequenza respiratoria. Ulteriori iniezioni di sodio pentobarbital deve essere somministrata, se necessario a 20mg/kg per mantenere aereo anestesia. L'aereo chirurgico di anestesia viene mantenuta in conformità con le normative federali e istituzionali, come indicato nel protocollo di cura degli animali approvato dalla cura degli animali e del Comitato uso (ACUC) della University of Northern aC.
- Rimuovere i capelli dalla zona addominale e fianchi / hip da rasoio. Eliminare le rimanenti capelli sciolti da tampone imbevuto di alcool e picchiettando l'area con del nastro adesivo. Questo è sufficiente come questa procedura sperimentale è terminale.
- Posizionare il mouse su un bordo chiaro chirurgico in posizione supina e collegare il mouse al bordo con nastro adesivo ogni zampa alla scheda. La temperatura corporea è mantenuta attraverso una lampada di calore esterno e monitorati tramite termometro rettale per garantire che l'ipotermia non si verifica a causa di anestetico.
3. Procedura chirurgica
- Durante l'intera procedura chirurgica garantire tessuti esposti è sempre tenuto superfused con equilibrata soluzione PSS riscaldata. E 'anche importante fare mai il contatto con la vascolarizzazione di interesse con strumenti chirurgici o danneggiare i vasi mettendo a molta forza su di loro attraverso la manipolazione del tessuto adiposo e del tessuto connettivo che li circonda.
- Posizionare il mouse nell'ambito di applicazione dissezione. Fai una incisione lungo la linea mediana della superficie ventrale della cavità addominale e ritrarre la pelle in direzione della colonna vertebrale del mouse.
- Una volta che la pelle è ritratta in modo che la LN è facilmente visibile, la pelle perno su un piedistallo trasparente Sylgard 184.
- Rimuovere il sottile strato di tessuto connettivo sovrapponendo l'area intorno alla LN
- Chiara la sovrapposizione del tessuto adiposo e circondano il linfonodo finché il letto microvascolare è esposto. Il segmento principale arteria stabilisce adiacente alla LN ed è comunemente sovrapposto dal venule. L'intervento intero dura circa 30 minuti.
4. Imaging e Vessel Analysis
- Una volta che il segmento del vaso di interesse è esposto nell'ambito di applicazione dissezione, fissare il preparato sul microscopio intravitale. Si noti che animale rimane sul tabellone chiaro chirurgico, mentre il microscopio intravitale per tutta la durata dell'esperimento. La temperatura corporea è mantenuta attraverso lampada di calore e di misura mediante termometro rettale, come descritto nella sezione chirurgica. L'aereo anestesia è inoltre monitorato in tutto l'esperimento, come descritto nella sezione 2.1.
- Impostare il superfusione e le linee di aspirazione. Superfusione di PSS avviene a gravità da un serbatoio, nel serbatoio camicia d'acqua riscaldata (la giacca viene fatta circolare acqua e riscaldata dal bagnomaria circolante) di essere irrorati dal 5% di CO 2 di azoto equilibrato, e giù una linea a goccia ad una velocità di 10 ml / min. Una linea di aspirazione deve essere usato per continuare tirare PSS superfused dalla preparazione. Da notare che prima della sperimentazione le linee di aspirazione e camicia d'acqua sono accuratamente puliti e conservati dopo ogni esperimento. Questo assicura sterilità prima del prossimo esperimento.
- Controllare la temperatura del PSS superfusing. Regolare la temperatura delcircolazione bagnomaria e / o il tasso di superfusione PSS per raggiungere una temperatura di circa 37 ° C in tutta la preparazione.
- Lasciare che la vascolarizzazione a equilibrare con PSS per almeno 60 minuti e quantificare il diametro del vaso con la pinza video. Tipicamente, diametro del vaso deve essere determinata in più punti (ad esempio, a 40, 50 e 60 minuti) per garantire la nave si è stabilizzata.
- Valutare la salute della nave che utilizza un agonista della muscolatura liscia specifici (es. fenilefrina, PE) ed un agonista endotelio specifiche (es. acetilcolina, ACh). Concentrazione di agonista deve essere regolata a seconda della agonista, ma per PE e Ach la nave dovrebbe essere valutata per ogni concentrazione di oltre cumulativa (10-5M a 10-9M) al superfusate. Ogni applicazione agonisti devono essere separati da una fase di lavaggio (di solito 30 minuti) utilizzando PSS fino a quando la nave ritorna al diametro di riposo.
- In seguito alla valutazione della salute dei vasi sanguigni, le successive farmaci vasoattivi, etichettatura fluorescenti e celle tracciamento esperimenti possono essere condotti.
- Dopo la fine dell'esperimento l'animale viene data una dose eccessiva di sodio pentobarbital. L'animale viene poi monitorato per assicurare che non c'è risposta a pizzico punta e la mancanza di movimenti respiratori o di battito cardiaco. Nel momento in cui questa è seguita da dislocazione cervicale.
5. Rappresentante dei risultati:
Dopo il periodo di equilibrio della preparazione dovrebbe produrre un'immagine chiara che permette l'identificazione sia delle arteriole e venule che fornisce il nodo inguinale linfa. Ci dovrebbe essere cellule adipose minimo circostanti i vasi per consentire pareti della arteriole e venule essere chiaramente osservato per le pinze video da sovrapposte per calcolare diametro del vaso. Il punto integrante di una preparazione di successo is l'arteriola ha una ricca offerta di sangue si muove attraverso il lume e che ci sia un grado significativo del tono vascolare (cioè l'arteriola ha la capacità effetto vasocostrittore e vasodilate alla muscolatura liscia ed endoteliali agonisti specific rispettivamente) .
Figura 1. Immagine microscopia intravitale di linfonodi inguinali alimentazione arteriola nodo (freccia rossa) che alimentano il linfonodo equilibrata con soluzione fisiologica e che corre lungo il lato venule principale (freccia verde).
Figura 2. Normale risposta vasoattivi per fenilefrina superfused (PE) con l'aggiunta cumulativo di soluzione fisiologica dalle concentrazioni 10 -9 M per 10 -5 M. La presenza di una vasocostrizione robusta è indicativa di normale funzionamento della muscolatura liscia presente nella arteriole.
Figura 3. Normale risposta vasoattivi per superfused acetilcolina (ACh) con l'aggiunta cumulativo di soluzione fisiologica da concentrazioni di 10 -9 M per 10 -5 M. La presenza di una vasodilatazione robusta è indicativa della normale funzione endoteliale presente nelle arteriole.
Discussion
Microscopia intravitale del linfonodo inguinale qui presentata offre la possibilità di microcircolo immagine del linfonodo in vivo. Così, fornisce un mezzo di diretta, in tempo reale osservazione. Imaging del microcircolo LN è un sito unico che permette di studiare l'interfaccia tra la risposta immunitaria e la vascolarizzazione. Utilizzando questa preparazione, messa a fuoco può essere diretto specificamente alla risposta immunitaria, alterazioni del sistema vascolare, o interazione tra le due cose.
Come per tutti gli approcci sperimentali, un microscopio a intravitale ha sia vantaggi e limiti. IVM standard, come la preparazione descritta qui, può facilmente essere modificato, ed è stato precedentemente dimostrato dagli autori per consentire microscopia epifluorescente attraverso l'introduzione di coloranti traccianti fluorescenti o popolazioni di cellule con etichetta. Anche se IVM norma non garantisce la possibilità di tre di imaging tridimensionale e la rintracciabilità come sarebbe dato da microscopia a due fotoni o angiografia, il monitoraggio delle cellule è ancora realizzato in due dimensioni permettendo cellula-cellula e cellula-vascolarizzazione interazione da osservato e quantificato e in collaborazione con in-vivo di amministrazione e conseguente colorazione con anticorpi fluorescenti può essere usato per fornire i dati sulle proteine / marcatore espressione in tempo reale.
In particolare, le tecniche di imaging alternative richiedono un ambiente statico per le immagini; bloccaggio dell'area chirurgica o l'aggiunta di un coprioggetto su un piatto preparazione è spesso necessario. Questo limita, se non elimina, la capacità di perfusione attivamente mediatori vascolari o altro oltre alla preparazione per valutare l'integrità vascolare e la fisiologia, ecc o l'uso di altre tecniche come la vasodilatazione esperimenti condotti all'interno della preparazione IVM. Inoltre, standard IVM non richiede una preparazione completamente pianeggiante e non è influenzato dal movimento, come quello generato dalla respirazione degli animali. Questo permette IVM standard da utilizzare in zone più chirurgica con maggiore riproducibilità. Ciò è esemplificato dalla preparazione del linfonodo inguinale descritto qui. Date le dimensioni e la forma dei linfonodi, la preparazione non può essere piatta, senza ferire il tessuto e la posizione del nodo dà origine al movimento significativo a causa della respirazione animale. Tali problemi sarebbero difficili da superare con altri metodi, ma sono facilmente risolto con la preparazione standard di IVM descritto.
In sintesi, la preparazione cui sopra può essere combinato con qualsiasi numero di altri biochimici, vascolari, e / o tecniche immunologiche, come il trasferimento di sottoinsiemi di cellule attivate o etichettati, induzione di ipossia, e sovra-espressione di deplezione dei mediatori vascolari. Tuttavia, le applicazioni aggiuntive dipendono dalla salute della preparazione iniziale. Pertanto, è vitale per testare sempre la salute del sistema vascolare essere ripreso e valutato. Punti chiave per raggiungere una preparazione sanitaria sono garantire la preparazione è costantemente perfuso con PSS equilibrata alla temperatura del corpo e riducendo al minimo il contatto e lo stress immessi sul campo operatorio durante l'intervento chirurgico.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è finanziato dal Canadian Institutes of Health Research, Fondazione canadese per l'innovazione, University of British Columbia Centro di Ricerca del sangue e University of Northern aC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
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