Summary
사타구니 림프절 (LN)의 intravital 현미경을 수행하기위한 기법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 실시간으로 허용합니다
Abstract
체내에있는 임파선이 (LN의), 면역 체계의 중요한 구성 요소입니다. 그들은 그러므로 적응 면역 반응의 유도를위한 사이트로 봉사하고, 효과기 세포의 개발. 따라서 LNs가 침해 병원체와 싸우고과 건강을 유지하기 위해 열쇠입니다. 공부 LN의 선택은 접근하고 원하는 모델에 의해 결정되며 사타구니 림프 노드가 잘 위치하고 있으며 쉽게 피부와 성기 점막 감염 생물학 관련 모델의 연구를 지원합니다.
사타구니 LN, 모든 LNs 같이, 혈액으로 공급하는 광범위한 microvascular 네트워크 있습니다. 일반적으로,이 microvascular 네트워크는 높은 내피 venules (HEVs)를 피드 이후 지점과 LN의 주요 공급 arteriole를 포함합니다. HEVs는 항상성 및 감염 모두 동안 LN에 면역 세포의 인신 매매를 촉진을위한 전문입니다. HEVs 이러한 상황 모두에서 LN으로 거래를 규제하는 것은 얼마나 강렬한 탐구의 영역입니다. LN 피드 arteriole는 HEVs에 직접적인 영향을 업스트림 있으며 LN에 영양소와 세포 풍부한 혈액의 주요 공급됩니다. 또한 피드 arteriole의 변화는 적응 면역 반응의 유도를 촉진에 연루됩니다. LN microvasculature은 LN에 최적의 혈액 공급을 유지하고 적절한 LN 기능과 이후 면역 반응에 중요한 요소 LN로 면역 세포 유입을 규제의 명백한 중요성을했다.
생체내에서 LN microvasculature을 연구하는 능력은 면역 시스템과 microvasculature 상호 작용 및 LN 이내에 다른 영향을 어떻게 elucidating의 열쇠입니다. 여기, 우리는 사타구니 림프 노드의 생체내 이미징에 대한 방법을 제시한다. 우리는 건강한 혈관 연구, 몇 시간 동안 가능한 선박의 이미지를 유지하는 능력, 그리고 선박 규모의 부량을 보장 방법에 특히주의를 기울이고, LN의 microvasculature의 이미지에 중점을두고 있습니다. vasoactive 마약 microvasculature의 재관류뿐만 아니라 세포의 트래픽을 추적하고 계량 가능성에 대한 방법도 제시하고 있습니다.
사타구니 LN의 Intravital 현미경은 microvascular 기능과 면역 세포, LN, 그리고 엑기스 간의 직접적인 인터페이스의 실시간 인터페이스의 직접 평가를하실 수 있습니다. 많은 면역 기법과뿐만 아니라 다른 LNs의 vasculature 연구를 조작 형광 셀 라벨과 결합 될 가능성이 기술.
Protocol
1. 시약 준비
- 실험을하는 동안 사용할 시약은 수술 프로토콜을 시작하기 전에 준비를해야합니다. 모든 솔루션 살균 기술을 사용하여 만든다고합니다.
- 생리 생리 식염수 (PSS)는 최고의 두 가지 구성 요소에 준비 : 기본 소금 솔루션과 나트륨 중탄산염 솔루션을. 4 20X 농도 및 저장 ° C.에 두 솔루션을 준비 20X에서 나트륨 중탄산염는 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol)와 20X 농도에서 기본 소금 솔루션 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol) 40.0mM CaCl 2입니다 • 2 시간 2 O (147.02g/mol) 및 23.4mM MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). 솔루션 이전 다음 화학 물질을 추가해도 좋다 때까지 솔루션은 한 번에 하나씩 추가되어야 DH 2 O와 화학 물질에 준비하고 흔들해야
- 나트륨 중탄산염 및 기본 소금 솔루션의 같은 볼륨을 diluting 및 1X 농도 (DH 2 O의 각 나트륨 중탄산염 및 기본 소금 솔루션의 두 PSS의 2L 100mL 희석시키기위한 diluting하여 PSS의 2L 준비
- 37 ° C 물 목욕으로 PSS 및 PSS를 포함한 플레이스 2L 판매량 플라스크. 수술의 시작 이전에 1 시간을위한 5 % CO 2 / 밸런스 질소 가스와 함께 솔루션을 평형.
- Vasoactive 화학 물질은 (예 : 제품 Phenylephrine, 아세틸콜린, 나트륨 nitroprusside) 최고 -20 ° C.에 dH2O에서 1M 농도에서 준비하고 100μl aliquots에 저장됩니다
2. 동물 준비
- 마우스의 무게를 결정하고 intraperitoneal 주사로 90mg/kg에서 pentobarbital 나트륨의 초기 복용량을 관리할 수 있습니다. 절차를 통해 마우스가 지속적으로 발가락 핀치와 호흡 속도에주의 시험을 통해 마취의 비행기 모니터입니다. 마취의 비행기를 유지하기 위해 20mg/kg에서 필요에 따라 pentobarbital 나트륨의 추가 주사가 관리해야합니다. 노던 BC 대학교 동물의 관리 및 사용위원회 (ACUC)에 의해 승인 동물 관리 프로토콜에 명시된 바와 같이 마취의 수술 비행기는 연방 및 기관 규정에 따라 유지됩니다.
- 면도기로 복부와 측면 / 힙합 영역에서 머리를 제거합니다. 알코올 면봉으로 풀어 머리를 나머지와 테이프로 영역을 끝날 제거합니다. 이 실험 절차 터미널이므로이 충분합니다.
- 부정사 위치에 명확 수술 보드에 마우스를 놓고 이사회에 각 노상 강도를 녹화하여 보드에 마우스를 연결합니다. 체온은 외부 가열 램프를 통해 유지하고 저체온증은 마취의 결과로 발생하지 않습니다 보장하기 위해 직장 온도계를 통해 모니터링됩니다.
3. 수술
- 전체 수술 도중 노출된 조직은 항상 따뜻하게 equilibrated PSS 솔루션 superfused 유지되도록. 그들 주위 지방 조직과 결합 조직을 조작하여 그들을 더 강제로 삽입하여 수술 악기와 함께 관심의 vasculature 접촉을하거나 혈관을 다치게 안하는 것도 중요하다.
- 해부 현미경으로 마우스를 놓습니다. 복강의 복부 표면을 따라 정중선 절개를하고 마우스의 척수 칼럼으로 피부를 철회.
- 피부가 LN 쉽게 볼 수 있도록 철회되면, 투명 Sylgard 184의 받침대로 피부를 핀.
- LN 주변을 오버레이 결합 조직의 얇은 층을 제거
- 지방 조직의 오버레이를 해제하고 microvascular 침대 노출 때까지 림프 노드를 서라운드. 주요 간선 구간은 LN에 인접 낳는하고 일반적으로 venule에 의해 overlayed 있습니다. 전체 수술 시간은 약 30 분 소요됩니다.
4. 이미징 및 선박 분석
- 관심의 선박 세그먼트는 해부 현미경 노출되면, intravital 현미경에 대한 준비를 확보. 동물 동안 실험 기간 내내 intravital 현미경에 맑은 수술 보드에 남아 있습니다. 외과 섹션 중에 설명한 것처럼 체온이 가열 램프를 통해 유지 관리 및 직장 온도계를 통해 측정됩니다. 섹션 2.1에서 설명한대로 마취 비행기는 또한 실험을 통해 모니터링됩니다.
- superfusion와 흡입 라인을 설정합니다. PSS의 Superfusion는 5 % CO 2 평형 질소에 의해 perfused되고있는 물 재킷 가열 저수지 (물 재킷이 순환 waterbath에 의해 순환하고 가열)로하고 10ml의 속도로 드립 라인 아래로, 저수지에서 중력 공급에 의해 발생 / 분. 흡입 라인은 준비 가까이 superfused PSS 당겨 계속해서 사용해야합니다. 이전 실험에 흡입 라인과 물 재킷이 완전히 청소하고 각 실험 후 저장합니다. 이것은 다음 실험을하기 전에 불임을 보장합니다.
- superfusing PSS의 온도를 확인합니다. 의 온도를 조절° C 준비를 통해 ~ 37 온도를 달성하기 위해 물 목욕 및 / 또는 PSS superfusion의 속도를 순환.
- vasculature 적어도 60 분 PSS와 평형 및 비디오 캘리퍼스를 사용하여 혈관 직경을 정할 수 있습니다. 일반적으로, 선박의 직경은 선박이 안정 보장 (예를 들어, 40, 50, 60 분) 여러 지점에서 결정한다.
- 부드러운 근육 구체적인 작용제 (예 : 제품 Phenylephrine, PE) 및 내피 구체적인 작용제 (예 : 아세 티 콜린, ACH)를 사용하여 선박의 건강을 평가합니다. 작용제의 농도는 작용제에 따라 조정해야하지만, PE와 이크에 대한 배는 superfusate에 누적 이외 (10 - 9M 10 - 5M) 각 농도에 평가해야합니다. 각 작용제의 응용 프로그램은 선박이 휴식 직경으로 돌아갑니다까지 PSS를 사용하여 세척 단계 (일반적으로 30 분)으로 구분해야합니다.
- 실험을 추적 혈관 건강, 후속 vasoactive 마약, 형광 라벨, 그리고 세포의 다음 평가 실시 수 있습니다.
- 실험의 끝에 다음과 같은 동물은 pentobarbital 나트륨의 과다 주어집니다. 동물은 다음 발가락 핀치와 호흡 운동이나 심장 박동의 부족으로 응답이 없다는 것을 보장하기 위해 모니터링됩니다. 같은 시간에 이것은 자궁 경부 전위옵니다.
5. 대표 결과 :
평균 기간에 따라 준비는 사타구니 림프 노드를 공급 arteriole과 venule 모두의 식별을 허용 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. arteriole 명확하게 혈관 직경을 계산 겹쳐하는 비디오 캘리퍼스에 대해 관찰하는 venule의 벽 수 있도록 혈관을 둘러싼 최소한의 지방 세포가 있어야합니다. 성공적인 준비의 핵심 포인트는 arteriole의 루멘을 통하여 혈관 톤 상당 정도 (예 : arteriole가 vasoconstrict 각각 근육과 내피 특정 agonists를 부드럽게 vasodilate 수있는 능력을 가지고)가있다는 것을 이동하는 혈액의 풍부한 공급을 가지고있다 .
그림 1. 생리학 생리 식염수 측면을 따라 주요 venule (녹색 화살표)를 실행하는 equilibrated 림프 노드를 먹이 사타구니 림프 노드 피드 arteriole (빨간색 화살표)의 Intravital 현미경 이미지.
그림 2. 농도에서 생리 식염수로 누적 이외의 superfused phenylephrine (PE)에 일반 vasoactive 응답 10 -9 M ~ 10 -5 M. 강력한 vasoconstriction의 존재는 arteriole에있는 정상적인 평활근 기능의 암시이다.
그림 3. 농도에서 생리 식염수로 누적 이외의 superfused 아세틸콜린 (ACH)에 일반 vasoactive 응답 10 -9 M ~ 10 -5 M. 강력한 vasodilation의 존재는 arteriole 정상적인 내피 기능 현재의 암시이다.
Discussion
여기에 제시된 사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경은 림프절에 - 생체내의 이미지 microvasculature 수있는 기능을 제공합니다. 그러므로, 그것은 직접 실시간으로 관찰하는 수단을 용이하게합니다. LN microvasculature의 영상이 하나가 면역 반응과 vasculature 사이의 인터페이스를 연구 수있는 독특한 사이트입니다. 이 준비를 사용하여 초점은 면역 반응, vasculature의 변경, 또는 둘 사이에 상호 작용에서 특별히 지시하실 수 있습니다.
모든 실험 방법과 마찬가지로 표준 intravital 현미경은 장점과 한계를 모두하고 있습니다. 준비가 여기에서 설명한 같은 표준 IVM은 쉽게 수정할 수 있으며, 이전에 형광 추적 염료의 도입이나 레이블이 붙은 세포 집단을 통해 epifluorescent 현미경을 허용하는 저자에 의해 증명되었습니다. 표준 IVM은 입체 영상의 가능성을 포기하고 두 광자 현미경이나 혈관 조영술에 의해 제공됩니다과 같은 추적하지 않지만, 세포 추적은 여전히 휴대 전화와 휴대 vasculature 상호 작용 수 있도록 2 차원 이루어집니다 준수하고 계량 및 형광 항체로 - 생체내 관리 및 후속 얼룩과 함께 실시간으로 단백질 / 마커 표현에 대한 데이터를 제공하는 데 사용할 수 있습니다.
특히, 대체 영상 기술은 이미지에 대한 정적 환경을 필요로하며 수술 영역이나 평평한 준비에 coverslip의 추가의 클램핑하는 것은 자주 필요합니다. 이 제한이 아니라면, 제거, 적극적으로 혈관 무결성 및 생리학 등 또는 IVM 준비 내에서 실시 vasodilation 실험 같은 다른 기술의 사용을 평가할 수있는 준비를 통해 혈관이나 다른 중재자를 perfuse 수있는 능력. 또한, 표준 IVM은 완전히 평평하게 준비를 필요로하지 않습니다와 같은 동물의 호흡에 의해 생성된 것과 움직임에 의해 영향을받지 않습니다. 이것은 표준 IVM은 더욱 재현성 더 많은 수술 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 여기에서 설명한 사타구니 림프절 준비에 의해 exemplified입니다. 림프절의 크기와 모양을 감안할 때, 준비가 조직을 손상없이 평평 만들 수 없으며, 노드의 위치는 동물의 호흡으로 인한 움직임에 상당한 상승을 제공합니다. 이러한 문제는 다른 방법으로 극복하기 어려울 것이지만, 쉽게 설명된 표준 IVM 준비를 사용하여 처리하고 있습니다.
요약 위의 세부 준비는 어떤 번호로 조합하여 사용할 수 있습니다 다른 생화학, 혈관, 및 / 또는 활성화의 하위 집합을 양도하거나 표시 셀, hypoxia의 유도, 그리고 혈관 중재자의 고갈 이상의 표현으로 면역 기술. 그러나, 추가적인 응용 프로그램은 초기 준비의 건강에 따라 달라집니다. 따라서, 항상 몇 군데와 평가되는 vasculature의 건강을 테스트하기 위해 매우 중요합니다. 건강 준비를 달성하기위한 핵심 포인트는 준비가 지속적으로 체온에서 equilibrated PSS와 perfused 및 수술 중에 수술 영역에 위치 연락처 및 스트레스를 최소화됩니다 확보하고 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소, 혈액 연구 노던 BC의 대학의 브리티시 컬럼비아 센터의 혁신, 대학에 대한 캐나다 재단에 의해 후원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
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