Summary
Техника для выполнения прижизненной микроскопии паховых лимфатических узлов (ЛУ) описана. Такая методика позволяет в режиме реального времени,
Abstract
Лимфатических узлов (Л. Н.), расположенные по всему телу, являются неотъемлемой частью иммунной системы. Они служат в качестве сайта для индукции адаптивного иммунного ответа и, следовательно, развитие эффекторных клеток. Таким образом, LNS играют ключевую роль в борьбе вторжение болезнетворных микроорганизмов и поддержания здоровья. Выбор LN для изучения продиктована доступности и желаемой модели, паховые лимфатические узлы хорошо расположены и легко поддерживает исследования биологически соответствующих моделей кожи и слизистой оболочки половых инфекций.
Паховые Л. Н., как и все LNS, имеет разветвленную сеть капилляров снабжая его кровью. В общем, это микрососудистых сеть включает в себя основные артериол подачи LN, которые впоследствии филиалов и каналы высокой эндотелия венул (ВЗУ). ВЗУ являются специализированными для облегчения торговли иммунных клеток в Л. во время обеих гомеостаза и инфекции. Как ВЗУ регулировать торговлю в LN при обоих этих условий в районе интенсивных исследований. Л. Н. кормить артериол, имеет прямое влияние на входе ВЗУ и является основной запас питательных веществ и клеточных богатых крови в LN. Кроме того, изменения в питании артериол вовлечены в содействие индукции адаптивного иммунного ответа. Л. Н. микроциркуляторного имеет очевидное значение для поддержания оптимального кровоснабжения Л.Н. и регулирования притока иммунной клетки в Л.Н., которые являются ключевыми элементами в нормальной работы Л. Н., а затем иммунный ответ.
Способность к обучению Л. Н. микрососудов в естественных условиях является ключом к выяснению того, как иммунная система и микроциркуляторном взаимодействуют и влияют друг на друга в пределах LN. Здесь мы представляем метод в естественных изображений паховых лимфатических узлов. Мы делаем ставку на визуализацию микроциркуляторном русле Л.Н., обращая особое внимание на методы, которые обеспечивают изучение здоровых сосудов, способность сохранять изображения жизнеспособных судов в течение нескольких часов, и количественная оценка судна величины. Методы перфузии микроциркуляторного русла с вазоактивных препаратов, а также потенциал для выявления и количественной сотового трафика также представлены.
Прижизненные микроскопии паховые Л. Н. обеспечивает прямой оценки микрососудистых функциональность и в режиме реального времени интерфейс прямого интерфейса между иммунными клетками, Л. Н., и микроциркуляцию. Эта технология потенциально может быть в сочетании с много методов иммунологической и флуоресцентные маркировки клеток, а также манипулировать для исследования сосудистой других LNS.
Protocol
1. Подготовка реагентов
- Реагенты, которые будут использоваться в течение всего эксперимента должны быть подготовлены до начала хирургического протокола. Обратите внимание, что все решения были сделаны с использованием стерильной техники.
- Физиологический раствор (PSS) лучше всего подготовлен в двух компонентов: основной раствор соли и раствором бикарбоната натрия. Подготовка оба решения в 20х концентрации и хранить при 4 ° C. Бикарбонат натрия на 20X является 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) и щелочной раствор соли на 20X концентрация 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), а 23,4 MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Решения должны быть подготовлены в дН 2 O и химических веществ, должны быть добавлены по одному и перемешивают, пока раствор не станет прозрачным до добавления следующего химического
- Подготовка 2 л PSS путем разбавления равные объемы бикарбоната натрия и основные солевого раствора и разбавления до концентрации 1X (для двух 2 л разбавленного PSS 100 мл каждая бикарбоната натрия и щелочной раствор соли в дН 2 O
- Место 2L мерную колбу содержащие PSS PSS и в 37 ° С водяной бане. Равновесие раствора с 5% CO 2 / газовый баланс азота для 1 час до начала хирургического вмешательства.
- Вазоактивные химических веществ (например, Фенилэфрин, ацетилхолин, нитропруссид натрия) являются наиболее подготовленными в 1М концентрации в dH2O и хранится в 100 мкл аликвоты при -20 ° C.
2. Подготовка животных
- Определите вес мыши и управлять начальной дозы натрия пентобарбитал на 90mg/kg внутрибрюшинной инъекции. На протяжении процедуры мыши постоянно контролируется для анестезии плоскости через щепотку носок и тщательное изучение частоты дыхания. Дополнительные инъекции натрия пентобарбитал следует назначать в случае необходимости в 20mg/kg для поддержания анестезии плоскости. Хирургической анестезии плоскости ведется в соответствии с федеральным и институциональных положений, изложенных в протоколе по уходу за животными утвержденным уходу и использованию животных комитета (ACUC) из Университета Северной до нашей эры.
- Удалить волосы с живота и флангу / хип области, бритвы. Удалите оставшиеся свободные волосы тампоном, смоченным спиртом и похлопывая области с лентой. Этого достаточно, так как это экспериментальная процедура терминала.
- Наведите на четкой хирургической борту в лежачем положении и прикрепить мышь к борту каждой пятой лентой к доске. Температура тела поддерживается с помощью внешнего тепла лампы и контролировать с помощью ректального термометра, чтобы переохлаждения не возникает в результате анестезии.
3. Хирургические процедуры
- В течение всего хирургическая процедура обеспечения подвергаются ткани всегда держится superfused с уравновешенной нагревается решение PSS. Важно также, чтобы никогда не вступать в контакт с сосудистой интересов с хирургическими инструментами или наносить повреждения судов, размещая на много сил на них, манипулируя жировой ткани и соединительной ткани вокруг них.
- Наведите под рассекает области. Сделайте разрез по средней линии брюшной поверхности брюшной полости и убрать кожу к позвоночнику мыши.
- После того как кожа втягивается, так что Л. Н. хорошо видно, контакт кожи на пьедестал прозрачной Sylgard 184.
- Удалить тонким слоем соединительной ткани наложение область вокруг Л. Н.
- Открытый наложения жировой ткани и окружающие лимфатические узлы, пока микрососудистых кровати подвергается. Основной артериального сегмента лежит рядом с Л. Н. и обычно перекрыты венулы. Все операции занимает около 30 минут.
4. Работа с изображениями и судна Анализ
- Как только судно сегменте интерес подвергается при вскрытии рамки, безопасный препарат на прижизненной микроскопом. Обратите внимание, что животное остается на борту хирургические ясно то время как на прижизненной микроскопии на протяжении всего эксперимента. Температура тела поддерживается с помощью тепла лампы и измеряется с помощью ректального термометра, как описано в хирургическое отделение. Анестезии плоскости также контролируется в течение всего эксперимента, как описано в разделе 2.1.
- Настройка superfusion и всасывающей линий. Superfusion из PSS происходит самотеком подается из резервуара, в водяной рубашке нагревается резервуар (водяной рубашкой циркулирует и нагревается циркулирует водяной бане), которые перфузии на 5% CO 2 сбалансированный азота, и вниз по линии капли со скоростью 10 мл / мин. Всасывающего трубопровода должна быть использована для продолжения тянуть superfused PSS от подготовки. Обратите внимание, что до начала эксперимента всасывания линий и водяной рубашкой были тщательно очищены и сохраняется после каждого эксперимента. Это обеспечивает стерильность до следующего эксперимента.
- Проверьте температуру superfusing PSS. Отрегулируйте температуруциркулирующих ванну воды и / или скорость PSS superfusion для достижения температуры ~ 37 ° C по подготовке.
- Разрешить сосудистую, чтобы уравновесить с PSS, по крайней мере 60 минут и количественно диаметр сосуда с помощью видео суппорта. Как правило, диаметр сосуда должна быть определена в нескольких точках (например, при 40, 50 и 60 минут), чтобы обеспечить судно стабилизировалась.
- Оценка здоровья судна использованием гладких мышц специфическим агонистом (например, Фенилэфрин, PE) и эндотелий специфическим агонистом (например, ацетилхолин, АЧ). Концентрация агонист должна быть скорректирована в зависимости от агонистов, но для ПЭ и Ах судно должно быть оценено при каждой концентрации кумулятивным дополнение (10-5М до 10-9М), чтобы superfusate. Каждый агонист приложения должны быть разделены мыть фазы (обычно 30 минут), используя PSS, пока судно возвращается к отдыхает диаметре.
- После оценки судна здоровья, последующие вазоактивных препаратов, флуоресцентные маркировки и отслеживания ячейки эксперименты могут быть проведены.
- После окончания эксперимента животным дается передозировки натрия фенобарбитала. Животное затем контролироваться для обеспечения, что нет ответа на щепотку ног и отсутствие дыхательных движений и сердцебиения. На тех пор, за этим следует шейки дислокации.
5. Представитель Результаты:
После уравновешивания период подготовки должны давать четкое изображение, что позволяет идентифицировать и артериол и венулы, что поставки паховых лимфатических узлов. Там должна быть минимальной клетки жировой окружающих судов для обеспечения стенах артериол и венулы быть четко наблюдается для видео суппортами на накладываться рассчитать диаметр сосуда. Целая точка успешной подготовки артериол имеет богатый запас крови, проходящий через просвет, и что существует значительная степень тонуса сосудов (т.е. артериол имеет возможность vasoconstrict и вазодилатирующими на гладких мышц и эндотелиальных конкретных агонисты соответственно) .
Рисунок 1. Прижизненные изображения микроскопии паховых лимфатических узлов кормить артериол (красная стрелка) кормление лимфатических узлов уравновешенной физиологическим раствором и вдоль стороны основных венулы (зеленая стрелка).
Рисунок 2. Нормальная вазоактивные ответ на superfused фенилэфрин (PE) кумулятивным помимо физиологического раствора от концентрации 10 -9 M до 10 -5 М. Наличие надежной вазоконстрикции наводит на мысль о нормальной гладкой мышечной функции присутствуют в артериол.
Рисунок 3. Нормальные вазоактивные ответ на superfused ацетилхолина (АХ) кумулятивным помимо физиологического раствора от концентрации 10 -9 M до 10 -5 М. Наличие надежной вазодилатации наводит на мысль о нормальной эндотелиальной функции в настоящее артериол.
Discussion
Прижизненные микроскопии паховых лимфатических узлов, представленные здесь дает возможность изображения микрососудов из лимфатических узлов в естественных условиях. Таким образом, это облегчает средством прямого, в режиме реального времени наблюдения. Визуализация Л. Н. микроциркуляторного это уникальный сайт, который позволяет изучать взаимодействие между иммунной и сосудистой сети. Использование этого препарата, фокус может быть направлен конкретно на иммунный ответ, изменения в сосудистой сети, или при взаимодействии между ними.
Как и во всех экспериментальных подходов, стандартных прижизненной микроскопии имеет свои преимущества и ограничения. Стандартный IVM, такие, как подготовка, описанные здесь, могут быть легко изменены, и было ранее продемонстрировано авторами, чтобы epifluorescent микроскопии с помощью введения флуоресцентных красителей трассирующими или маркированы клеточных популяций. Хотя стандартные IVM не дает возможности трехмерной визуализации и трассировки, такие как бы дается двухфотонной микроскопии или ангиографии, сотовые отслеживания до сих пор достигнуто в двух измерениях позволяет клетки к клетке и клетка-сосудистой взаимодействие будет наблюдается и в количественном выражении и в сочетании с в естественных условиях администрации и последующим окрашиванием флуоресцентными антитела могут быть использованы, чтобы дать данные о белка / маркер выражение в режиме реального времени.
Примечательно, что альтернативные методы визуализации требуют статической среды для изображений; зажим хирургический области или добавление покровное на плоской подготовки часто необходимо. Это ограничивает, если не исключает, способность активно заливать сосудистых или других посредников по подготовке к оценке целостности сосудистой и физиология и т.д., или использовать другие методы, такие как проводится вазодилатации экспериментов в IVM подготовки. Кроме того, стандартные IVM не требует абсолютно плоской подготовки и не зависит от движения, как, например, порожденных дыхание животного. Это позволяет стандартным IVM, которые будут использоваться в более хирургических областях с большей воспроизводимости. Примером этого может служить паховых лимфатических узлов подготовки описаны здесь. Учитывая размер и форма лимфатического узла, препарат не может быть сделан плоским, не повредив ткани и расположения узлов приводит к возникновению существенного движения из-за животных дыхания. Такие вопросы трудно будет преодолеть с помощью других методов, но легко дело с использованием стандартного препарата IVM описано.
Таким образом, подготовка подробного выше, может быть объединена с любым количеством других биохимических, сосудистых и / или иммунологические методы, такие как передача подмножеств активирован или меченых клеток, индукции гипоксии, и чрезмерной экспрессии истощение сосудистой посредников. Тем не менее, дополнительные приложения, которые зависят от здоровья начальной подготовки. Таким образом, жизненно важно, чтобы всегда проверять здоровье сосудистой время отображаемого и оценены. Ключевые моменты для достижения здоровья подготовки является обеспечение подготовки постоянно озарен уравновешенной PSS при температуре тела и минимизация контакта и нагрузки на хирургическое области во время операции.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансируется Канадским институтом медицинских исследований, Канадский фонд инноваций, Университета Британской Колумбии Центра исследований крови и Университет Северной до нашей эры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
