En teknik för att utföra intravital mikroskopi av inguinal lymfkörtlar (LN) beskrivs. Sådan teknik kan i realtid,<em> In vivo</em> Studie av lymfkörtel mikrocirkulation och struktur både under homeostas och infektion. Denna teknik kan anpassas till studier cell människohandel och till andra lymfkörtel webbplatser.
Lymfkörtlar (LN: s), som finns i hela kroppen, är en integrerad del av immunförsvaret. De fungerar som en plats för induktion av adaptiva immunsvar och därmed utvecklingen av effektor celler. Som sådan, LNS är nyckeln till kampen mot invaderande patogener och bibehålla hälsa. Valet av LN att studera styrs av tillgänglighet och önskad modell, inguinal lymfkörtel har ett bra läge och lätt stöder studier av biologiskt relevanta modeller av hud och genitala slemhinnor infektion.
Inguinal LN, som alla LNS har ett omfattande mikrovaskulära nätverk förse den med blod. I allmänhet innebär detta mikrovaskulära nätverk de viktigaste fodret arteriole av LN som sedan grenar och flöden högt endotel venoler (HEV). HEV är specialiserade för att underlätta handel av immunceller till LN under både homeostas och infektion. Hur HEV reglerar människohandel till LN inom bägge dessa omständigheter är ett område med intensiv prospektering. LN foder arteriole har direkt uppströms inflytande på HEV och är den främsta tillgången på näringsämnen och cell rika blod i LN. Dessutom är förändringar i fodret arteriole inblandade i att underlätta induktion av adaptiva immunsvaret. LN mikrocirkulation har uppenbara betydelse för att upprätthålla en optimal blodtillförsel till LN och reglera immunceller tillströmning till LN, som är avgörande faktorer i rätt LN-funktion och därefter immunförsvaret.
Möjligheten att studera LN mikrocirkulation in vivo är nyckeln till att belysa hur immunsystemet och mikrocirkulation samspelar och påverkar varandra i LN. Här presenterar vi en metod för in vivo-avbildning av inguinal lymfkörtel. Vi fokuserar på avbildning av mikrocirkulation i LN, med särskilt beaktande av metoder som säkerställer att studera friska fartyg, förmågan att bibehålla avbildning av livskraftiga fartyg över ett antal timmar, och kvantifiering av fartygets storlek. Metoder för perfusion av mikrocirkulation med vasoaktiva läkemedel samt möjlighet att spåra och kvantifiera cellulära trafiken presenteras också.
Intravital mikroskopi av inguinal LN möjliggör direkt bedömning av mikrovaskulära funktionalitet och realtid gränssnittet i den direkta gränssnittet mellan immunceller, LN och mikrocirkulation. Denna teknik skulle kunna kombineras med många immunologiska tekniker och fluorescerande celler märkning samt manipuleras för att studera kärl av andra LNS.
Intravital mikroskopi av inguinal lymfkörtel som presenteras här ger möjlighet att bilden mikrocirkulation av lymfkörteln in-vivo. Därför underlättar det en form av direkt, i realtid observation. Imaging av LN mikrocirkulation är en unik webbplats som tillåter en att studera samspelet mellan immunförsvaret och kärlsystemet. Med hjälp av denna beredning kan fokus riktas specifikt på immunförsvaret, förändringar i kärlsystemet, eller på interaktion mellan de två.
Som med alla experimentella metoder, har standard intravital mikroskopi både fördelar och begränsningar. Standard IVM, såsom utarbetande beskrivs här, kan lätt ändras, och har tidigare visat av författarna för att epifluorescent mikroskopi genom införande av fluorescerande spårämne färgämnen eller märks populationer cell. Även om vanliga IVM inte ger möjlighet till tredimensionell avbildning och spårning som skulle ges av två-photon mikroskopi eller angiografi, är cell tracking fortfarande uppnås i två dimensioner så att cell-till-cell och cell-till-kärlsystemet samverkan ska observeras och kvantifieras och i samband med in-vivo administrering och efterföljande färgning med fluorescerande antikroppar kan användas för att ge data om protein / markör uttryck i realtid.
Särskilt alternativ avbildningstekniker kräver en statisk miljö för bilder; fastspänning av kirurgiska området eller tillägg av ett täckglas på en plan förberedelse är ofta behövs. Detta begränsar, om inte eliminerar, förmågan att aktivt BEGJUTA vaskulär eller andra mediatorer under förberedelserna för att utvärdera vaskulär integritet och fysiologi etc. eller användning av andra tekniker som bedrivs vasodilatation experiment inom IVM beredning. Dessutom kräver standarden IVM inte en helt platt beredning och påverkas inte av rörelse, såsom den som genereras av andningen av djuret. Detta gör att standard IVM att användas i större kirurgiska områden med större reproducerbarhet. Detta exemplifieras av inguinal lymfkörtel förberedelse beskrivs här. Med tanke på storleken och formen på lymfkörtel, kan preparatet inte göras platt utan att skada vävnaden och placeringen av noden ger upphov till betydande rörelse hänsyn till djurens andning. Sådana frågor skulle vara svåra att övervinna med andra metoder, men kan lätt behandlas med användning av standarden IVM beredningen beskrivits.
Sammanfattningsvis kan beredningen beskrivs ovan kombineras med någon rad andra biokemiska, kärl, och / eller immunologiska metoder såsom överlåtelse av delmängder av aktiverade eller märkta celler, induktion av hypoxi, och över-uttryck för utarmning av vaskulära medlare. Men ytterligare program är beroende av hälsan för den första behandlingen. Därför är det viktigt att alltid testa hälsa kärlsystemet som avbildas och utvärderas. Viktiga poäng för att uppnå en hälso-beredning är att säkerställa förberedelserna ständigt perfusion med jämvikt PSS vid kroppstemperatur och minimera kontakten och stress placeras på operationsområdet under operationen.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras av den kanadensiska Institutes of Health Research, kanadensiska institutet för innovation, University of British Columbia Centrum för Blood forskning och University of Northern BC.
Name of the reagent | Company |
---|---|
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich |
Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich |
Phenylephrine | Sigma Aldrich |
Acetylcholine | Sigma Aldrich |
Magnesium chloride heptahydrate | Sigma Aldrich |
Sodium Pentobarbitol |