Orthotopic Xenografting mänskliga luciferas-taggade Malignt Perifera tumör Nerve Slida celler för In vivo Testning av kandidat behandlingsmetoder

Summary

En metod för att tillförlitligt ympning luciferas-märkta mänskliga maligna perifera nervceller slida tumör i ischiasnerven av immundefekta möss beskrivs. Användningen av mareld avbildning för att visa god etablering av tumör transplantat och kriterier för slumpmässiga segregation av djur till studiecirklar diskuteras också.

Abstract

Även om in vitro-skärmar är väsentliga för den första kartläggningen av kandidatländer terapeutiska medel, en noggrann bedömning av läkemedlets förmåga att hämma tumörtillväxt måste utföras i en lämplig djurmodell. Den typ av djurmodell som är bäst för detta ändamål är en livlig diskussion. Vissa tecken tyder på att prekliniska studier avseende läkemedelseffekter på tumörer som uppstår i transgena möss är mer prediktiva för kliniskt utfall ¹ och så kandidat terapeutiska medel är ofta testas i dessa modeller. Tyvärr, transgena modeller är inte tillgängliga för många tumörtyper. Vidare transgena modeller har ofta andra begränsningar som gäller för hur väl musen tumörmodeller dess mänskliga motsvarighet, ofullständig penetrans av tumören fenotyp och en oförmåga att förutsäga när tumörer kommer att utvecklas.

Följaktligen många utredare använder xenograft modeller (mänskliga tumörceller ympas in immundefekta möss) för prekliniska studier vid behov transgena tumörmodeller är inte tillgängliga. Även om transgena modeller finns tillgängliga, är de ofta samarbetar med xenograft modeller som de senare underlätta ett snabbt fastställande av terapeutiska intervall. Vidare ger detta partnerskap en jämförelse av effektivitet agent i transgena tumörer och verkliga mänskliga tumörceller. Historiskt sett har xenografting ofta utförts genom att injicera tumörceller subkutant (ektopisk xenografter). Denna teknik är snabb och reproducerbar, relativt billigt och möjliggör kontinuerlig kvantifiering av tumörtillväxt under den terapeutiska perioden ^2. Dock är den subkutana utrymmet inte den normala mikromiljön för de flesta tumörer och så resultaten med ektopisk xenografting kan vara missvisande på grund av faktorer såsom en avsaknad av organ-specifika uttryck värd vävnad och tumörer gener. Det har därför varit starkt rekommenderat att ektopisk ympning studier bytas ut eller kompletteras med studier där humana tumörceller ympas in i deras vävnad ursprung (orthotopic xenografting) ^2. Tyvärr är genomförandet av denna rekommendation ofta hindras av det faktum att orthotopic xenografting metoder ännu inte har utvecklats för många tumörtyper.

Malignt perifer nerv slida tumörer (MPNSTs) är mycket aggressiva sarkom som förekommer sporadiskt eller i samarbete med Neurofibromatos typ 1 ³ och oftast uppstår i ischiasnerven ^4. Här beskriver vi en tekniskt enkel metod där eldfluga luciferas-märkta mänskliga MPNST celler orthopically xenografted i ischiasnerven av nedsatt immunförsvar möss. Vår strategi för att bedöma framgången för ympning förfarande i enskilda djur och efterföljande icke-partisk randomisering i studiecirklar är också diskuteras.

Protocol

1. Första bearbetning av icke-nakna immundefekta möss (inte nödvändigt för nakna stammar):

1. Alla rutiner har granskats och godkänts i förväg av UAB Institutional Animal Care och användning kommittén och utförs av väl utbildad personal. Vi har framgångsrikt använt tre stammar av immundefekta möss för dessa experiment: en) Foxchase utavlat SCID möss (CB17/lcr- Prkdc ^Scid / lcrCrl möss), b) NIH III mus (NIHS-Lyst ^BG Foxn1 ^nu BRK ^xid möss), och c ) NOD-SCIDγ möss (NOD.Cg-Prkdc ^Scid Il2rg ^tm1Wjl / SzJ möss). I våra händer, är tillväxten av orthotopic implanterad nästan identiska i NIH III och NOD-SCIDγ möss, som båda bär mutationer som påverkar funktionen av T-celler, B-celler och NK-celler, för detta protokoll, antalet dagar som krävs för odling av moderplantor tillväxt, den tidpunkt då behandlingen påbörjas och tiderna efter ympning när bildbehandling utförs är de som vi har empiriskt bestämmas med hjälp av NOD-SCIDγ möss. Graft tillväxt i Foxchase utavlat SCID möss, som har defekter i T-och B-cellernas funktion, vanligtvis tar längre tid.
2. För att underlätta ympning av ett stort antal icke-nakna immundefekta möss, tar vi bort hår från operationsområdet på eftermiddagen före ympning. Möss är bedövas med hjälp av en isofluran induktionskammare ansluten till en förångare med bildningen av avgaserna. För att upprätthålla kroppstemperaturen, är djuren hanteras på värmedyna under hela denna process. Clippers används för att avlägsna hår från mitten av tillbaka ner till knäet i bakbenet på den sida som ska ympas. Eventuella återstående hår är försiktigt bort från platsen i ~ 5 minuter med hjälp av ett kemiskt hårborttagningsmedel medel (t.ex. Nair, i synnerhet en produkt med aloe vera för känslig hud). Borttagning av hårborttagningsprodukter produkten rekommenderas då det kan leda till irritation på hud, ögon och andra ytor organ som det kan sprida sig. Vi vill inte ympa både ischias nerver i dessa experiment eftersom detta bilateralt kan försämra bakben funktion, vilket resulterar i förlust av möss från studiegrupperna.
3. Möss får återhämta sig helt på en värmedyna i en isolerad bur utan sängkläder, vilket både gör att möss inte skadas av andra, mer fullständigt alert djur och hindrar dem från att oavsiktligt andas in sängar. När möss är helt mobil och visar inga tecken på grogginess kan de återinföras i en bur med andra möss.

2. Beredning av MPNST celler för injektion på dagen av Ympning

1. I detta protokoll särskilda nummer av celler ympade och den tid som krävs för tumörtillväxt efter ympning är de som vi har empiriskt fastställts för ST88-14 celler, ett vanligt MPNST linje som härrör från en NF1-associerad tumör ^5. De celler vi använder för ympning har transduced med en Lentiviral vektor som innehåller en CMV-luciferas-IRES-puromycin kassett och kloner stabilt uttrycka eldfluga luciferas identifieras av mareld avbildning ^6. Vi har också utfört ympning experiment med MPNST celler stabilt transfekterade med plasmider som uttrycker eldfluga luciferas under kontroll av CMV omedelbar tidigt promotor. Vi rekommenderar inte detta som vi har funnit att dessa plasmid vektorer är benägna att genomgå utdöende uttryck efter ympning.
2. ST88-14-celler odlas i Dulbecco är minimal viktigt medel kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 10 mikrogram / ml streptomycin och 10 IU / ml penicillin (DMEM10), 5 mikrogram / ml puromycin ingår också att hålla val för Lentiviral vektor. Vi har behållit dessa celler i vårt laboratorium för 50 stycken och har inte observerat några skillnader i celltillväxt i någon av dessa passager. 9 x 10 ⁵ ST88-14 celler är klädd i en T175 kolv och odlas för 3 dagar, då kolven är ca 80% konfluenta. Att ympa 35 möss, är en enda 80% konfluenta T175 kolv krävs, vid denna densitet, är vår genomsnittliga avkastningen för ST88-14 celler 7,3 x 10 ⁶ celler per T175 kolv. Det är mycket viktigt att cellerna inte tillåtas växa till sammanflödet före skörd för ympning. Vi har funnit att ympning cellerna skördas från konfluenta kolvar resulterar i en högre grad av transplantat misslyckande och ofta förlänger in vivo loppet av transplantat tillväxt.
3. ST88-14 celler sköljs en gång med rumstemperatur Hanks balanserade saltlösning. Celler tas bort från kolven med Cell Stripper cell dissociation lösning i 30 sekunder till 1 minut vid rumstemperatur. Fem milliliter DMEM10 (Obs: puromycin ingår inte i detta medium) per varje milliliter av Cell används Stripper läggs sedan till cellerna.
4. Celler räknas med hjälp av en hemocytometer. 5 x 10 ³ ST88-14 celler upphängd i 3 mikroliter kommer att injiceras per mus. En mängd celler som är tillräcklig för att ympa hela kohorten, med hänsyn till pipetteringfel (t.ex. för 35 möss, vi brukar överföra ett antal celler räcker för att ympa 40 möss), överförs till ett sterilt 1,5 mL rör. Cellerna är centrifugeras vid 3000 rpm i 5 minuter. Supernatanten försiktigt bort och cellpelleten återsuspenderade i DMEM10 (Obs: puromycin ingår inte i detta medium) till en slutlig koncentration av 5 x 10 ³ celler per 3 mikroliter. Håll cellerna på is.

3. Ympning Protokoll

1. Möss bedövas i induktion kammare en isofluran Vaporizer tills de inte längre dra tillbaka sina bakdelen på en tå nypa stimulans. Möss placeras på deras sida och injiceras subkutant med 0,05 mg / kg buprenorfin hydrocholoride. Anestesi bibehålls sedan genom kontinuerlig tillförsel av isofluran levereras via näsa-kon. Observera att ett avlivas möss har använts för att demonstrera detta förfarande till videon, varför är det isofluran slang används för att leverera isofluran inte syns i videon.
2. För att upprätthålla kroppstemperaturen, är djuren hanteras på värmedyna under hela ympning processen. För att förhindra att hornhinnan uttorkning, en liten droppe av oftalmologiska salva (Puralube veterinär salva) ges till varje öga. Eftersom det kommer att bli nödvändigt att varje mus som ska identifieras under hela försöksperioden, är ett öronmärke med en unik identifierare nummer klippt till höger öra varje mus.
3. Placera djuret på magen, sprider sig bakbenen. Täck musen med en steril duk, utsätta kirurgiska fönster (flank) där ympning kommer att inträffa. Den steril duk bör ge visualisering av huvudet, både för att se till att näsan är fortfarande inne i konen och att tillåta övervakning av andning och djurets färg. Applicera Betadine till operationsområdet med en bomullstuss tippas applikatorn, med början i mitten av flanken och gradvis spiral utåt kanterna av kirurgiska fönster. 70% etanol tillämpas sedan på operationsområdet på samma sätt. Rad tillämpningar av Betadine följt av etanol upprepas två gånger.
4. Avlägsna cellerna från is och antingen Vortexa försiktigt eller flick röret till resuspendera bosatte celler. Med pipett bort 3,2 mikroliter av cellsuspensionen och mata ut den på en bit av Parafilm. Genom att ta bort mer än vad som behövs och placera fjädring på Parafilm, kan vi säkerställa att det inte finns några bubblor i fjädring och att vi har en fullständig 3 mikroliter för injektionen. Dra så mycket av cellsuspensionen möjligt i en 10 mikroliter Hamilton spruta försedd med en 33 gauge nål. Flick bubblor från sprutan och utvisa överskottet cellsuspension till exakt 3 mikroliter. Håll celler och celler som innehåller spruta på is tills den ska användas, för att säkerställa att nålen är steril, inte tillåter kontakt med is eller hinken. En bit av saran wrap kan placeras ovanpå isen till sprutan från direkt kontakt med isen.
5. Med hjälp av en Nr 4 skalpell handtag utrustad med en nr 22 skalpell blad, gör ett snitt genom huden i flanken strax under och parallellt med lårbenet, se till att snittet inte sträcker sig utanför gränserna för kirurgiskt tvättas området. Öppna huden snitt med ett kirurgiskt clamp eller manuellt för att exponera den underliggande muskeln. En fascian planet kommer att vara synlig köra längs benet, ischiasnerven ligger under denna och mellan de två musklerna förbinds av fascia. Använda ett par vassa spets sax, trubbig dissekera genom denna fascia att exponera ischiasnerven, som bör vara visar sig som en vit linjär struktur om tjockleken på en tjock tråd.
6. Använda ett par vassa spets böjd peang försiktigt dissekera under nerv, lossa den från den underliggande muskeln, vilket både höjer och isolerar nerven. Lämna pincetten i nerven att behålla denna position. Försiktigt in nålen i Hamilton sprutan i nerven, försöker upprätthålla vinkel injektion som parallellt med nerv som möjligt så att nålen inte punktera genom undersidan av nerven. Nålen bör införas mot slutet av nerven distalt om ryggraden, har vi funnit att injektion av tumörceller i nerven till ryggmärgen fastställer de ympade tumörceller i närmare anslutning till ryggmärgen. När detta inträffar tumörceller invaderar ofta ryggmärgen, vilket leder till för tidig förlust av djur från studiegruppen på grund av äventyrande av ryggmärgen funktion.
7. När nålen är rätt placerad i nerven, slappna av spänningen som produceras i nerven med pincett och långsamt injicera celler från sprutan i nerven under 45-60 sekunder. Det är viktigt att detta sker långsamt så snabbt utvisning av sprutans innehåll kommer resultera i en "back-wash" av tumörceller runt injektionsstället och deras förlust. Efter att alla celler har framgångsrikt injicerats, långsamt ut kanylen för att minimera förlusten av injicerade materialet.
8. Ta bort förCEPS och försiktigt placera nerv tillbaka till sin ursprungliga plats under muskeln. Stäng det kirurgiska ingreppet med Vetbond kirurgiskt lim. Håll snitt tillsammans med pincett för cirka 20 sekunder för att låta limmet torka.
9. Musen är bort från isofluran näsa-konen och placeras ensam i ett sängar utan bur att återhämta sig. Denna bur bör hållas på toppen av en värmedyna tills djuret återhämtat sig helt. En del av återhämtningen buren inte ska vara på en värmedyna, ger detta djuret att flytta bort från värmen om de blir för varma. Efter ympning bör djuren bedömas regelbundet för att tugga på platsen, hälta eller anorexi, dessa tecken kan tyda på djuret är fortfarande smärta och att lämplig analgetika ges. Efter att ha fått erfarenhet av detta förfarande har vi funnit att 30-40 möss lätt kan ympas på en enda dag.

4. Bedömning av Graft Framgång och randomisering Into Study Groups

1. Bioluminescens avbildning används för att bedöma framgången för ympning förfarande. Vi använder en IVIS-100-systemet (ursprungligen från Xenogen, som nu är känt som Klavar Inc.) för att upptäcka Ljusemissionen från tumör-uttryckta eldfluga luciferas som produceras som ett resultat av den kemiska reaktionen av luciferas med sitt substrat, D-luciferin . Analyser av dessa bilder avgöra om specifika ympade möss är lämpliga för inresa till behandlingsförsök årskullar. I preliminära försök har vi kvantifierat mareld signaler upptäckas, offrade ympade möss, skördade sina tumörer och korrelerad tumör vikter med mareld signaler från regionen av intresse analyser enligt tillverkarens Living bildbehandlingsprogram. Dessa studier visade att det fanns ett linjärt samband mellan tumör transplantat vikter och mareld ljus utsläpp, vilket indikerar att bioluminescens avbildning är en lämplig ersättning sätt att utvärdera xenograft tillväxt under hela prekliniska försök. Normalt har vi bild 5 möss på samma gång. Ytterligare information om mareld avbildning tidigare publicerats ^7.
2. För att bedöma transplantat framgång, är mareld bildbehandling utförs 1 och 3 dagar efter ympning. Bilderna samlas in från möss orienterade i samma läge 10 min efter intraperitoneal injektion av 2,5 mg D-luciferin. Vid avbildning, är möss som upprätthålls enligt isoflurananestesi och deras kroppstemperatur hålls vid 37 ° C med en värmedyna som finns i Xenogen kameran. Bild förvärv tider är i storleksordningen 2 sek till 10 min, den datainsamling programvara försäkrar att inga pixlar är mättade under bildsamling. Ljusemissionen från tumör regioner (relativ fotonen räknas / sek) mäts med hjälp av egenutvecklade programvara från Xenogen. Ljus utsläppsintensitet representeras av pseudofärger skalning av mareld som overlayed på svartvita fotografier av möss som samlas på samma gång.
3. För att vara berättigad för införande i en preklinisk studie kohort måste möss har en påvisbar mareld signal både 1 och 3 dagar efter ympning och intensiteten i mareld signalen måste öka mellan dag 1 och 3. Djur som har ett minskat eller statiska signalen är exkluderade. Dessutom bör signaler upptäckts i möss ympade på samma dag vara inom en storleksordning av varandra, möss med mareld signaler som är en storleksordning lägre eller högre än de som påvisas hos djur ympade på samma dag är undantagna.
4. När möss har identifierats som uppfyller dessa kriterier måste de randomiserats till behandling grupper. För att uppnå detta, 3 dagar efter ympning luciferas signaler upptäcks i ympade möss är först beställas från högsta till lägsta intensitet. Möss är sedan randomiserats i grupper genom att ge dem för intensitet att behandlingsgrupperna, vända denna ordning och sedan upprepa processen tills alla möss tilldelas grupper. Till exempel, om det finns fyra behandlingsgrupperna (t.ex. placebo och tre koncentrationer av test läkemedel) möss som tilldelats grupperna i ordningen 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. etc. Innan behandlingsstart är mareld signalerna upptäcks i varje medlem av den tilldelade grupp i genomsnitt att se till att den genomsnittliga start signaler inom alla grupper så nära som möjligt. Administration av kandidaten terapeutiskt medel påbörjas på dag 3.
5. För att bedöma effekten av terapeutiskt medel har på transplantat tillväxt under loppet av behandlingen, mareld bildbehandling utförs en gång i veckan efter att ha påbörjat behandling (dag 10, 17, 24, 30 efter ympning). För icke-nakna immundefekta möss, är det ytterst viktigt att djur igen har nya päls tillväxt bort med Nair före genomför varje avbildning session. Detta beror på att håret block självlysande signaler, med pälsfärgen avgöra hur mycket av signalen går förlorad. Till exempel är vit päls som finns på schweiziska Webster möss ger en 18% minskning av självlysande signalstyrka ^8, medan svart päls kan minska signaler så mycket som 10-faldig ^9. Vi vill också notera att det inte kan antas att ett enhetligt päls återväxt kommer att inträffa i alla behandlingsgrupper och "normalisera" minskningar signalen mellan behandlingsgrupperna. Detta beror på att terapeutiskt medel i sig kan påverka hårväxten. Till exempel har vi noterat att tamoxifenbehandling hämmar hår återväxt, vilket minimerar den upplevda effekten av detta läkemedel på tumörtillväxt jämfört med placebo-behandlade möss.
6. Med ST88-14 MPNST celler, kan möss göras under 30 dagar efter ympning. Vid denna tid, tumörer vanligtvis har vuxit till maximal tillåten storlek av institutionella djurvård och kommittéer använda och måste offras. Efter det slutliga avbildning sessionen, är möss dödas och prover som behövs för vidare analys av behandlingsresultat (t ex blod för bestämning av cirkulerande nivåer av terapeutiskt medel, tumörvävnad för vikt beslutsamhet, granskning av histologi, bestämning av Ki67 och Tunel index märkning och bedömning av biokemiska parametrar) som samlats. Exakt vad prover samlas in beror på de behov som experimentell design.
7. Möss med tumörer bör övervakas dagligen och upp om de blir sjuka (brist normala grooming och beteenden undvikande), inte kan äta eller dricka, eller om tumören blir alltför stora att de hindrar kroppens normala rörelse. Tumörbörda bör inte tillåtas överstiga 10% av djurets normala kroppsvikt. Tumör vikt i procent av kroppsvikten beräknas genom att jämföra vikten av tumören med djuren till vikten av ålder / kön matchad kontrollgrupp djur. Kakexi bör inte tillåtas bli kliniskt signifikant. Viktminskning i tumör-bärande djur bör inte överstiga 20% av normal kroppsvikt.

5. Representativa resultat:

Figur 1 visar den typiska successiv ökning av mareld observerades 1 till 18 dagar efter ympning i en väl etablerad orthotopic xenograft i en naken (NIH III) mus (AC). Kvantifiering av mareld signaler observerade 1-24 dagar efter ympning visar att även dessa signaler successivt öka tumörtillväxt markant ökar i de senare stadierna av studietiden (figur 1D). Att strikt visa att tumören tillväxten har skett inom ympade möss samlar vi rutinmässigt ischiasnerven och, om det framgår att tumören har spruckit på epineurium och invaderade intilliggande vävnad, omgivande mjukdelar och skelett muskler. Med tanke på den aggressiva tillväxten av MPNSTs, är det inte förvånande att vi ofta tycker att de ympade tumörceller har brutit mot de normala hinder av nerv och invaderade angränsande vävnader (figur 1E). Vi har också ofta att ympas MPNST celler vandrar aggressivt i nerv proximala och distala att transplantatet platsen.

Figur 1. Mareld avbildning av NIH III mus orthotopically ympas med luciferas-märkta MPNST celler 1 dag efter ympning (A). Observera att signalerna detekteras inom regionen av intresse (ROI) på olika möss är alla inom en storleksordning av varandra. Reimaging 10 dagar (B) och 18 dagar (C) efter ympning visar att självlysande signaler successivt öka i transplantatet platsen i enskilda möss. (D) Diagram som illustrerar progressiv ökning av den relativa fotonen räknas / sekund upptäcks över transplantatet plats 1-24 dagar efter ympning. (E) Photomicrograph av transplantat webbplats från den här musen att visa tumörtillväxt och fokal invasion till intilliggande skelettmuskulaturen.

Discussion

De detaljerade orthotopic xenografting metoden som presenteras här är en som vi utvecklat med hjälp av ST88-14 MPNST celler, en linje som ofta används i studier av dessa NF1-associerade perifera tumörer nerv slida. Dock är denna metod lätt att anpassa för prekliniska studier med andra linjer MPNST cellen. Till exempel har vi också utfört orthotopic xenografting med STS-26T ¹⁰ celler, en linje från en sporadiskt förekommande MPNST och T265-2c ¹¹ celler, som härrör från en NF1-associerad MPNST, med framgång liknande den som vi observerade med ST88 -14 celler.

Med detta sagt, skulle vi notera att de exakta villkoren vi beskriver här för orthotopic xenografting av ST88-14 celler inte direkt kan antas för ympning av andra MPNST linjer. I stället måste nyckelparametrar av metoden vara empiriskt bestämmas för varje cell linje. Dessa parametrar inkluderar antalet MPNST cellerna initialt ympade, tidsfristen för moderplantor för utveckling och, i mindre utsträckning, där volymen tumörcellerna injiceras. Att etablera dessa parametrar för en ny linje, vi transplantat grupper av möss (5 möss per grupp) med ³ till 5 Oktober x 10 ⁶ tumörceller, kontroll två koncentrationer av celler för varje storleksordning (dvs 10 ³ celler, 5 x 10 ³ celler, 10 ⁴ celler, 5 x 10 ⁴ celler, etc.). Större antal tumörceller (> 10 ⁶⁾ måste injiceras i en större volym, vi har funnit att upp till 5 ml kan injiceras utan förlust av celler från ympade nerv. Vi har också funnit att inte mer än 5 x 10 ⁶ tumörceller per 5 ml kan injiceras i tätare suspensioner blivit alltmer benägna att klippa som dödar tumörcellerna. Vi följer dessa möss tills minst tre djur inom varje grupp har påtaglig tumörer, då vi avslutar den gruppen och undersöka nerven histologiskt att bekräfta transplantat tillväxt. Självklart, den tid som krävs för att nå denna punkt kommer att variera beroende på antalet injicerade celler, i allmänhet, söker vi en koncentration av celler som kommer att nå maximal tillåten tumörtillväxt inom 30-60 dagar. Snabbare tillväxt kan göra det svårt att uppnå effektiv terapeutiska koncentrationer innan uppsägning av experiment och / eller förhindra att samla in tillräckligt datapunkter bioluminescens bildbehandling under loppet av experimenten. En tidsperiod längre än 60 dagar gör att justera experimentella parametrar tungrott och onödigt förlänger varaktigheten av de planerade experiment.

Slutligen vill vi också notera att vi har använt denna orthotopic xenografting metodik med ST88-14 celler ympas in NIH III möss för att visa den terapeutiska effekten av tamoxifen ^6. En detaljerad beskrivning av de metoder vi rutinmässigt använder för att bedöma effekterna av kandidaten terapeutiska agenter orthotopic xenografter finns i manuskript. Det har också visats att neurofibrom celler framgångsrikt kan ympas in perifer nerv ^12, vilket tyder på att, med ändringar, kan de förfaranden som beskrivs i detta protokoll användas för att utföra prekliniska studier med kandidat-terapeutiska medel mot neurofibrom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Foxchase outbred SCID mice	Charles River Laboratories	#236
NIH III mice	Taconic	#NIHBNX
NOD-SCIDγ mice	Jackson Laboratory	#005557
Cell Stripper	Fisher Scientific	25-056-cl
Vetbond surgical glue	3M	1469SB
Hamilton syringe	Hamilton Co	#80030	10 μL volume
Hamilton syringe needles	Hamilton Co	#7803-05	33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)
Ear tags	National Band and Ear Tag Co.	1005-1
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38