Summary
mStrawberry OP9 התאים מאפשרים הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל מתרבות משותפת.
Abstract
התמיינות של תאים במבחנה ES כלפי גורל התא hematopoietic שימושי כאשר לומדים אוכלוסיות תאים שקשה גישה in vivo ו לאפיון גנים המוקדם מעורב hematopoiesis, מבלי להתמודד עם lethalities עובריים. ES/OP9 שיתוף התרבות מערכת תוכנן במקור כדי לייצר צאצאים hematopoietic, ללא ייצור של מעל מקרופאגים, כמו קו OP9 תא סטרומה נגזר מכסה הגולגולת של עכברים מוטנטים osteopetrosis כי חוסר פונקציונלי M-CSF. במערכת במבחנה שיתוף תרבות ES/OP9 ניתן להשתמש כדי לשחזר פיתוח hematopoietic מוקדם. כאשר תאים בתרבית על OP9 סטרומה, תאים עובריים להתמיין Flk-1 + hemangioblasts, אבות hematopoietic, ובוגרת ולבסוף, שושלות הבדיל סופניים. תקן ES/OP9 שיתוף התרבות פרוטוקול מחייב את המיקום של תאים ES על שכבת ומחוברות OP9 של תאים, כמו גם צעדים replating תקופתיות כדי להסיר את הישן, זיהום OP9 תאים. יתר על כן, פרוטוקולים הנוכחי לערב להעריך רק את התאים hematopoietic למצוא השעיה ולא מותאמים הערכה של הצאצאים ES-נגזר על כל יום של בידול. עם זאת, עם צעדים replating ואת קצירת של תאים ההשעיה רק פוטנציאל מחמיץ חלק גדול של צאצאים ES-derived ופיתוח תאים hematopoietic. נושא זה הופך להיות חשוב לטפל כאשר מנסים לאפיין פגמים hematopoietic הקשורים קווי ES בנוקאאוט. כאן אנו מתארים שונה ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות, המאפשרת מניעת זיהום OP9 תאים מבחני במורד הזרם. שיטה זו מאפשרת הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל כלל ימים של תרבות משותפת, וכתוצאה מכך דפוס בידול hematopoietic, אשר באופן ישיר יותר מתאים לדפוס בידול hematopoietic נצפתה בתוך העובר.
Protocol
1. הכנת תאים ES
- ES התרבות התאים על פי פרוטוקול סטנדרטי קו התא הספציפי שלך. הקפד להכין תאים ES מספיק על צלחת של תאים OP9 mStrawberry יום 0 (תאים ES יהיה מצופה ב 1x10 ^ 3 ס"מ 2 תאים לכל יום בו 0)
2. הכנת OP9 תאים
- לפני גדל OP9 תאים mStrawberry, להכין את OP9 התקשורת צמיחה
OP-9 תרבית תאים בינונימניות סופי קונצרט כלשהו. נפח (מ"ל) aMEM 39.5 FBS (OP-9 נבדק) 100% 20% 10 L-גלוטמין 100x (200mm) 2mm 0.5 50 מ"ל
חנות ב 4 ° C ושימוש בתוך שבוע הכנה - כדי לשמור על mStrawberry OP9 תאים, התקשורת חייבת להיות שונה בכל 2 ימים תאים צריך להיות subcultured לפני תאים להגיע confluency (תת על 70-90% confluency). mStrawberry OP9 בתרביות תאים לא בוגרים מעבר ל -90% confluency כמו זו תגרום הבידול שלהם לתוך adipocytes. ראה איור 3.
- התאים על ידי תאים תת כביסה 2X עם PBS (או 1x עם PBS% + 0.1 1x עם טריפסין-EDTA)
- הוסף טרום חימם 0.1% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (או עד תאים לנתק)
- כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף OP-9 בינוני צמיחה. העברת התאים שפופרת 50 מ"ל קונית.
- תאים גלולה בשעה XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מחק supernatant.
- תאים Resuspend ב טרי OP9 התקשורת mStrawberry צמיחה
- פלייט תאים בצפיפות מינימום של 4 תאים 10 / 2 ס"מ
- לגדול mStrawberry OP9 התאים confluency החל 3 ימים לפני יום הדרושים שיתוף culturing תאים ES (יום 0, יום 5, או Day8 / 9 של הניסוי)
3. ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות
- הכן שותף תרבות התקשורת בידול
מניות סופי נפח (מ"ל) aMEM 39.5 FBS 100% 20% 10 L-גלוטמין 200mm 2mm 0.5 50 מ"ל - mStrawberry OP9 תאים (יום -3)
- תמיד תת OP9 תאים -3 הימים, כך שיש לך שכבות של ומחוברות OP9 תאים mStrawberry עבור 0 יום של תרבות משותפת. ראו תרשים 4 ב. פלייט mStrawberry OP9 תאים ב 1x10 4 / 2 ס"מ עבור confluency ב יום 0. הקפד תאים עודפים תת ליום 5 ויום 09/08 להמשך תרבות משותפת.
- ES / mStrawberry OP9 שיתוף התרבות הגדרת (יום 0)
- שטפו תאים ES 2x עם PBS
- Trypsinize תאים ES עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA, דגירה של 5min @ 37 ° C
- הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול לתאי
- גלולה ES תאים ב 400xg, 5-7min, RT. בטל supernatant
- תאים Resuspend ב Co-תרבות התקשורת בידול
- הסר מדיה OP9 תאים mStrawberry
- הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול כדי צלוחיות mStrawberry OP9
- פלייט 1x10 3 תאים ES / 2 ס"מ על בקבוק של OP9 תאים mStrawberry. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם לחות.
- mStrawberry OP9 תאים (יום 2)
- MStrawberry תת OP9 כך יש לך ומחוברות שכבות של תאים OP9 mStrawberry יום 5 של תרבות משותפת. פלייט mStrawberry OP9 תאים ב 1x10 4 / 2 ס"מ עבור confluency יום ב 5 (כמו בשלב 3.2). הקפד תאים עודפים תת ליום 8 / 9, במידת הצורך (כמו בשלב 2.2).
- ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 3)
- מוציאים בזהירות בינוני מתרבות שיתוף ולהחליף בינוני טרי משותף תרבות בידול
ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 5)
- לשטוף בזהירות שיתוף תרבויות 2x עם PBS
- Trypsinize תאים עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA
- לשטוף את הבקבוק תאים עם שותף לתרבות התקשורת בידול
- תאים גלולה בשעה 400xg, 7min, RT. מחק supernatant
- הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול לתאים. השתמש מחט 21-מד bluntended resuspend אל התאים ולהבטיח להשעיה תא בודד
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer. האם יש 100-150 גידול של פי מספר תאים ES מיום 0.
- Re-זרע 6.48x10 4 / 2 ס"מ - 7.76x10 4 / 2 ס"מ שיתוף התרבות התאים על שכבה חדשה של ומחוברות, OP9 תאים mStrawberry
- יום 5 מבחני-נותרת שיתוף התרבות תאים יכול לשמש עבור ניתוח תזרים cytometry, cytopreps (30K תאים), מבחני CHIP, וכו '
- ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 8 / 9 ויום 12)
- הסר מדיה בידול מן הבקבוק ולשמור. לשטוף monolayer 1x עם PBS להסיר תאים hematopoietic ההשעיה. לזרוק אל מחוץ לתאי hematopoietic.
- Trypsinize תאים חסיד עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA
- לשטוף את הבקבוק תאים עם התקשורת בידול ES ולהוסיף תאים hematopoietic למצוא השעיה =
- תאים גלולה בשעה 400xg, 7min, RT. מחק supernatant
- הוסף משותף תרבות בידול התקשורת או PBS לתאים. השתמש מחט 21-מד bluntended resuspend אל התאים ולהבטיח יחיד השעיית ספירת תאים תאים באמצעות hemocytometer.
- שיתוף התרבות ניתן נמשך 14 ימים כדי להעריך אבות hematopoietic יותר בוגרת מחדש על ידי זריעת שיתוף התרבות תאים על גבי שכבה חדשה של ומחוברות, OP9 תאים mStrawberry בכל יום 8 או 9 ואז שוב ביום 12. Re-תא זרע מספר אופטימיזציה המבוסס על התאוששות התא נדרש יום assay.
- הערכה של הצאצאים ES-derived (יום 1-14). ES-derived הצאצאים ניתן להעריך בכל יום של תרבות משותפת על ידי זרימת מיון תאים שלילי mStrawberry (ES-derived הצאצאים).
- הסר מדיה בידול מן הבקבוק ולשמור. לשטוף monolayer 1x עם PBS להסיר תאים hematopoietic ההשעיה. אין להשליך החוצה תאים hematopoietic.
- Trypsinize תאים חסיד עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA
- לשטוף את הבקבוק תאים עם שותף לתרבות התקשורת בידול ולהוסיף תאים hematopoietic למצוא השעיה
- גלולה תאים ב 400xg, 7min, RT. בטל supernatant
- תאים Resuspend עם מחט 21-מד לספור bluntended ו
- הצאצאים ES-derived (תאים שלילי mStrawberry) יכול להיות זרימה של מיון mStrawberry OP9 תאים חיובית. הצאצאים ES-derived אז יכול להיות מאופיין על ידי ניתוח תזרים cytometry, cytopreps, מבחני CHIP, וכו '
4. נציג תוצאות:
באיור 1. ES / mStrawberry OP9 משותף התרבות המערכת. המעבדה שלנו משתמשת במערכת במבחנה ES תא שיתוף התרבות לפיתוח מודל hematopoietic. במערכת שיתוף תרבות זו, תאים ES להבדיל, לתוך hemangioblasts ב Day5, כאשר הניח על שכבה של ומחוברות OP9 תאים mStrawberry. כמו שיתוף תרבות התמורה, מבשרי hematopoietic נוכחים יום 8, בעוד שושלות hematopoietic הבדיל סופני להופיע עד יום 14. החצים מצביעים על ימים של בידול כאשר passaging של הצאצאים ES-נגזר על שכבות ומחוברות חדש של תאים OP9 mStrawberry ב הצורך.
איור 2. ES פרופר התמיינות תאים. לתאי גזע עובריים הם זורעים על שכבת ומחוברות של mStrawberry OP9 ב יום 0. ES-derived הצאצאים מתחילים להיות גלוי בכל יום 3 של בידול, עם ES-derived הצאצאים נראה כמו מקבץ של תאים עם גבול מוגדר או מתחילים ליצור דפוס במערבולת. Hemangioblasts, שהם מבשר mesodermal משותף השושלות האנדותל hematopoietic, אמור להופיע כמו נערמו דורים של תאים בכל יום 5. עבור שיתוף תרבות תקופות ארוכות יותר מחמישה ימים, ES-derived הצאצאים אמור להופיע כמו אשכולות של תאים hematopoietic. שניים עד ארבעה אשכולות תאיים, יום ב 6 / 7, אמורה להופיע ולצמוח לתוך צבירי תאים גדולים עד יום 09/08 של תרבות משותפת. הצאצאים ES אחרים הנגזרים מצויים גם קשור בחוזקה שכבת תאים חסיד סטרומה.
איור 3. הבחנה מוצלחת תא ES. תוצאות מתרבות שיתוף זה משקף הבחנה פסולה תא ES. שים לב איך הצאצאים ES-derived אינם מופיעים בדפוס במערבולת ב יום 5. היעדרם של תאים דפוס במערבולת מציין היווצרות hemangioblast פסולים. אם hemangioblast לא מתפתח כראוי, ולאחר מכן המשיך שיתוף תרבות תגרום בידול ננסיים השושלת hematopoietic. משותף עם היווצרות תרבויות hemangioblast פסולים אמור להיות מושלך.
איור 4. mStrawberry OP9 תא תרבויות. (א) תא mStrawberry OP9 הם subcultured בביתConfluency 70-90%. (ב) הבחנה נכונה, תאים ES ו ES-derived הצאצאים מונחות על שכבת ומחוברות מדי של תאים OP9 mStrawberry.
איור 5. נציג ES / mStrawberry OP9 שותף תרבות פרופיל זרימה. כל הצאצאים ES-derived הם תאים שלילי mStrawberry וניתן תזרים מיון מן OP9 תאים mStrawberry. תא mStrawberry שער שלילי נקבע באמצעות ES/OP9 המסורתית שיתוף תרבות.
Discussion
התמיינות תקינה של תאים ES ומחוברות על שכבה של תאים OP9 תוצאות mStrawberry בייצור Flk1 hemangioblasts + בכל יום 5 של תרבות משותפת. Hemangioblasts אמור להופיע כמו נערמו למעלה דורים של תאים, כפי שנצפה באיור 1. במשך שארית של תרבות משותפת, הצאצאים גלוי ES-derived אמור להופיע כמו אשכולות של תאים hematopoietic (איור 1). בשלב Day6 / 7 03:58 אשכולות התא אמור להופיע ולצמוח לתוך אשכולות תא גדול (הן חסיד ועל השעיה) על ידי ביום 8 / 9 של תרבות משותפת. הצאצאים ES אחרים הנגזרים מצויים גם הדוק בתוך שכבת התאים חסיד סטרומה.
אמנם לא מופיע בפרוטוקול, חשוב לבדוק מראש FBS בשימוש במדיום ES צמיחה, mStrawberry OP9 התקשורת הצמיחה ES / mStrawberry OP9 התקשורת בידול. נבדק כראוי בסרום צריכה להבטיח צמיחה תקינה של תאים OP9 mStrawberry, כמו גם, התמיינות תקינה של תאים ES בתרבות המשותפת עד יום 5 של בידול. כחלופה או בנוסף OP9 תאים mStrawberry, OP9 תאים יכול להיות מוקרן, ב 8000 rads, לקראת זריעת ב confluency (7.8x10 4 תאים / ס"מ 2). הקרנה של OP9 תאים מאפשר לחיסולה של צעדים replating חוזרות ונשנות, וכן, מאפשר ביטול כמעט מוחלט של הישן, זיהום OP9 תאים מבחני במורד הזרם.
OP9 התאים היו שהונדסו חלבון mStrawberry ידי transducing OP9 תאים עם 3ug/mL של mStrawberry וקטור lentiviral להביע תחת שליטתו של מקדם CMV (pRRLsin-CMV וקטור, וקטור הליבה UCLA).
תקן ES/OP9 שיתוף תרבות פרוטוקולים כרוך את המיקום של תאים ES על OP9 ומחוברות שכבת תאים, כמו גם, 5 היום צעד replating על מנת לצמצם ישנים, מזהמים OP9 תאים מעבר לתא. בנוסף, רק תאים hematopoietic למצוא ההשעיה יוסרו להערכת הצאצאים ES-derived. עם זאת, בצעד הן replating ואת קצירת של תאים ההשעיה רק פוטנציאל מתגעגע מספר לא מבוטל של המתפתח בתאי גזע עובריים שמקורם hematopoietic. נושא זה הופך להיות חשוב לטפל כאשר מנסים לאפיין פגמים hematopoietic הקשורים קווי ES בנוקאאוט. כדי לעקוף בעיה זו המעבדה שלנו השתמשו שונה שיתוף התרבות, באמצעות mStrawberry-לבטא OP9 תאים. זה מבטיח כי כל הצאצאים ES מועברים להמשך שיתוף התרבות ביום 5, ועל היבול של הצאצאים ES-derived כל מבחני במורד הזרם. שינוי זה מספק כלים שימושיים בהערכת ואפיון של הצאצאים hematopoietic נגזר האדם והן ES קווי העכבר.
זה ES-mStrawberry OP9 שיתוף התרבות המודל משחזר את השלבים השונים פרימיטיבי hematopoiesis סופי. בשנת לימוד בשלבים המוקדמים של הפיתוח hematopoietic, אנשים רבים להשתמש BL-CFC (הפיצוץ דמוי תא המושבה להרכיב) assay, אשר להעריך את התפתחות hemangioblast מהתא ES. בעוד assay BL-CFC הוא כלי שימושי כאשר חוקרת התפתחות hematopoietic מוקדם, mStrawberry-ES שיתוף התרבות מערכות תערוכות השירות להגדיל שכן היא מאפשרת להערכת hemangioblast, כמו גם, שושלות hematopoietic מבוגר יותר.
עבודות קודמות באמצעות OP9/ES מסורתיים בידול פרוטוקולים EB הוכיחו כי גורמים נוספים הדרושים אולי, כמו overexpression של HoxB4, על מנת להפיק לטווח ארוך repopulating בתאי גזע hematopoietic במבחנה. עבודה נוסף יש צורך להעריך אם mStrawberry שלילית, מיון ES-derived אוכלוסיות מכילים נכון בתאי גזע hematopoietic.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים U. Ganapati להקמת ובדיקה של הקו OP9 mStrawberry התא. בנוסף, אנו מודים ח Shafifor הסיוע שלה עם התרבות המשותפת. HP נתמכת על ידי מענק מן הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (F31HL087714) (HP). התוכן של עבודה זו היא באחריות הבלעדית של המחבר ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של לב ריאה הלאומי, ודם המכון או המכון הלאומי לבריאות (NIH). Cytometry זרימה UCLA מתקן Core נתמכת על ידי NIH (CA-16042 ו-AI-28697), סרטן Jonsson מרכז האיידס UCLA המכון, ובית הספר לרפואה של UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
| ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
References
- Baron, M. H. Embryonic origins of mammalian hematopoiesis. Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).
- Baron, M. H. Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation. Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).
- Baron, M. H., Fraser, S. T. The specification of early hematopoiesis in the mammal. Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).
- Ganapati, U. Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression. Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).
- Hogan, B. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).
- Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).
- Nakano, T. Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro. Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).
- Nakano, T. In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis. Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1098 (1994).
- Turksen, K. Embryonic stem cells : methods and protocols. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).
