小鼠胰岛隔离

Summary

Protocol

胶原酶制备

1. 称取50 ml锥形加隔离缓冲 ，使终浓度，如表所示的胶原酶。涡旋溶解胶原酶。
   
   
   （+ 2额外的小鼠12只小鼠= 14小鼠× 5毫升/鼠标= 70毫升的总胶原酶溶液）
   
   
   （70毫升× 0.5毫克/毫升或0.3 mg / ml的胶原酶P总= 35毫克或21毫克）
   
   
   

   应变	年龄	胶原酶P（mg / ml的）	时间（min）
   C3H，BALB / C，B6	> 12周	0.8	17
   C3H，BALB / C，B6	<= 12周	0.5	13
   点头，NOR，非	> 12周	0.8	17
   点头，NOR，非	<= 12周	0.5	17

   
   
   
2. 免除到每个玻璃小瓶，置于冰上胶原酶溶液2毫升。每5毫升注射器装入3毫升胶原酶添加30克针和冰的地方准备在引擎盖。

腹胀

1. 前清扫术，颈椎脱位而牺牲的动物。喷雾用70％的ETOH全身，使其完全湿透。请在生殖器部位开始V型insision。所以尾巴正面临着远离你的鼠标旋转。
2. 删除打开鼠标左侧肠。这将会使胰腺和胆总管。
3. 广场上的小肠，胆管水渠两侧的止血钳，留下一个小口袋胶原酶溶液进入肠道。
4. 膨胀通过与30克针和包含3毫升冷胶原酶溶液5毫升注射器的胆管，胰腺，胆囊开始。
5. 从体内取出的胰腺和它放置在一个硅的含胶原酶溶液2毫升的小瓶。这一步应该很快完成，并且尽可能干净，减少脂肪和结缔组织的集合。
6. 放置在冰上，然后重复步骤3与下鼠标的小瓶。

消化

1. 每个小瓶密封，放入37℃水浴。孵育13-17分钟（时间与应变和动物的年龄而异）。
2. 时间结束后，大力摇动小瓶。胰腺土崩瓦解。
3. 通过大型无菌水槽滤网倒入每个消化成无菌的1000毫升烧杯中，并有力地移液器关闭屏幕，用洗涤液。分送消化到50毫升conicals管（3 pancreata/50 ml管：如果n = 12，使用足够的洗涤液，使终体积为200毫升和分配到4x50毫升管）。稀释应采取迅速和冰 ，以避免不必要的胰岛消化 。
4. 离心：启动离心机。当它达到1300转时，将其关闭。
5. 吸出上清液，留下〜5毫升。必须非常谨慎，不吸沉淀。
6. 用你的手大力攻悬浮颗粒，然后添加50毫升缓冲液洗。
7. 离心：启动离心机。当它达到1300转时，将其关闭。
8. 5毫升洗涤液，重悬沉淀和洗涤。
9. 转让5毫升到15毫升锥形和自旋向下，如上。
10. 尽可能完全吸出上清液。 （剩余的缓冲区可能导致聚蔗糖密度的变化。）

聚蔗糖

快速执行。长期聚蔗糖接触有毒的小岛。

1. 确保颗粒是彻底打破了之前加入聚蔗​​糖（完整的组织是很难重悬在聚蔗糖）。
2. 涡旋大力7毫升的聚蔗糖，密度1.108，重悬沉淀。
3. 层上的每个聚蔗糖2毫升为了在这余下的密度密度：1.096，1.069，那么1.037。
4. 4度在1800 rpm的旋转15分钟， 以断绝！
5. 选择从第二层使用spoid（无菌p胰岛lastic吸管）。将所有集合的50毫升锥形含有约25毫升冷缓冲区。
6. 以上，洗净，用洗涤液（重复步骤12-15）的3倍。
7. 悬浮胰岛在20毫升的RPMI - 1640（含10％胎牛血清和青霉素和链霉素，HEPES的MEM - NEAA），轻轻混匀。取出100 UL的样品进行计数。
8. 转移100 UL 35毫米网格板含1毫升媒体和1毫升双硫腙。
9. 的RPMI 1640培养尚存的胰岛细胞，在37 ° C，7％的_CO 2培养箱，在160毫米板共30毫升媒体/板。
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal