Murine eilandjes van Langerhans Isolatie

Summary

Protocol

Collagenase Voorbereiding

1. Weeg de collagenase in een 50 ml conische en voeg isolatie buffer aan de uiteindelijke concentratie, zoals aangegeven in de onderstaande tabel te maken. Los van de collagenase door vortexen.
   
   
   (12 muizen + 2 extra muizen = 14 muizen x 5 ml / muis = 70 ml in totaal collagenase oplossing)
   
   
   (70 ml x 0,5 mg / ml of 0,3 mg / ml = 35 mg of 21 mg collagenase P totaal)
   
   
   

   Spanning	Leeftijd	Collagenase P (mg / ml)	Tijd (min)
   C3H, Balb / C, B6	> 12 weken	0.8	17
   C3H, Balb / C, B6	<= 12 weken	0.5	13
   NOD, NOR, NIET	> 12 weken	0.8	17
   NOD, NOR, NIET	<= 12 weken	0.5	17

   
   
   
2. Doseer 2 ml collagenase-oplossing in elk glazen flacon en leg ze op ijs. Laad elk 5 ml spuit met 3 ml collagenase 30g naald en plaats in ijs (bereiden kap).

Uitzetting

1. Net voor dissectie, offeren van dieren door cervicale dislocatie. Spuit het hele lichaam met 70% van EtOH, waardoor het volledig nat. Maak een V-insision vanaf het genitale gebied. Draai met de muis, zodat de staart is van je af gericht.
2. Verwijder de darm naar de linkerkant van de open muis. Dit zal blootstellen de alvleesklier en de galbuis.
3. Plaats een hemostat klem aan beide zijden van de dunne darm, waar de galwegen riool, waardoor er een klein vakje voor collagenase oplossing om de darm in te voeren.
4. Blaas de alvleesklier via de galwegen met een 30g naald en 5 ml spuit met 3 ml koud collagenase-oplossing, te beginnen bij de galblaas.
5. Haal de alvleesklier van het lichaam en plaats deze in een gesiliconiseerde flacon met 2 ml collagenase oplossing. Deze stap moet snel en zo schoon mogelijk gebeuren, het minimaliseren van inzameling van vet en bindweefsel.
6. Plaats de flacon op het ijs en herhaal stap 3 met de volgende muis.

Spijsvertering

1. Seal elke flacon en plaats deze in een 37 ° C waterbad. Incubeer gedurende 13-17 minuten (de tijd varieert met de stam en leeftijd van het dier).
2. Na verloop van tijd is verstreken, krachtig schudden de flacon. De alvleesklier moet uit elkaar vallen.
3. Giet elke vertering door middel van een grote steriele wastafel zeef in een steriele 1000 ml bekerglas en krachtig pipet van het scherm af met het wassen buffer. Doseer het verteert in 50 ml conicals buizen (3 pancreata/50 ml tube: als n = 12, gebruik genoeg wasbuffer aan de uiteindelijke volume van 200 ml te maken en het afzien om 4x50 ml buizen). De verdunning moet snel en op ijs worden gedaan om ongewenste eilandje spijsvertering te voorkomen.
4. Spin down: Start van de centrifuge. Als het 1300 rpm bereikt, uit te schakelen.
5. Zuig het supernatant, waardoor ~ 5 ml. Wees zeer voorzichtig niet aan de pellet zuigen.
6. Resuspendeer pellet door te tikken krachtig met uw handen, voeg dan 50 ml wasbuffer.
7. Spin down: Start van de centrifuge. Als het 1300 rpm bereikt, uit te schakelen.
8. Resuspendeer de pellet en was met 5 ml wasbuffer.
9. Breng de 5 ml tot 15 ml conische en spin down, zoals hierboven.
10. Zuig het supernatant zo volledig mogelijk in. (Resterende buffer kan leiden tot de verandering van de dichtheid van de Ficoll.)

Ficoll

Uit te voeren snel. Lange-termijn blootstelling Ficoll is giftig voor eilandjes.

1. Zorg ervoor dat pellet is compleet gebroken voordat tot het toevoegen van Ficoll (aaneengesloten weefsel is moeilijk om opnieuw in suspensie in Ficoll).
2. Resuspendeer de pellet in 7 ml Ficoll, dichtheid 1.108, door vortexen krachtig.
3. Laag op de top van elk dichtheid van Ficoll 2 ml van elk van de overgebleven dichtheden in deze volgorde: 1.096, 1.069, dan 1,037.
4. Spin gedurende 15 minuten bij 1800 rpm bij 4 graden, met een break OFF!
5. Kies eilandjes van de tweede laag met behulp van spoid (steriel pLastic pipet). Breng alle collecties om een ​​50 ml conische met ~ 25 ml koud buffer.
6. Wassen, zoals hierboven, drie keer met wasbuffer (herhaalt u stap 12-15).
7. Resuspendeer eilandjes in 20 ml RPMI-1640 (met 10% FCS en penicilline en streptomycine, HEPES, MEM-NEAA) toe en meng voorzichtig. Verwijder de 100 ul van het monster voor het tellen.
8. Breng 100 ul tot 35 mm Grid-plaat met 1 ml van media en 1 ml dithizone.
9. Incubeer de resterende eilandjes in RPMI 1640, in een 37 ° C, 7% CO ₂ incubator, in 160 mm platen met een totaal van 30 ml van de media / plaat.
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal