Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Summary

Protocol

Kollajenaz Hazırlık

1. Son konsantrasyon, aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi yapmak için bir 50 ml konik ve eklemek izolasyon tampon içine kollajenaz tartılır . Vorteks kollajenaz eritin.
   
   
   (12 farelere + 2 ekstra fareler = 14 farelerin x 5 ml / fare = 70 ml toplam kollajenaz çözüm)
   
   
   (70 ml x 0.5 mg / ml veya kollajenaz P toplam 0.3 mg / ml = 35 mg veya 21 mg)
   
   
   

   Gerginlik	Yaş	Kollajenaz P (mg / ml)	Süresi (dak)
   C3H, Balb / C, B6	> 12 hafta	0,8	17
   C3H, Balb / C, B6	<= 12 hafta	0,5	13
   NOD, NOR OLMAYAN	> 12 hafta	0,8	17
   NOD, NOR OLMAYAN	<= 12 hafta	0,5	17

   
   
   
2. Kollajenaz çözüm 2 ml cam şişe ve yeri içine buz üzerinde her koyun. Her kollajenaz eklemek 30g iğne ve buz (motor kapağı hazırlamak) 3 ml ile 5 ml şırınga yükleyin.

Şişme

1. Sadece diseksiyonu önce servikal dislokasyon hayvan kurban. Tamamen ıslak ETOH% 70 ile tüm vücut spreyi. Genital bölgede başlayan bir V-insision olun. Fare kuyruğu size bakacak şekilde çevirin.
2. Açık farenin sol tarafına bağırsak çıkarın. Bu, pankreas ve safra kanalı gösterecektir.
3. , Bağırsak girmek için kollajenaz çözümü için küçük bir cep bırakarak, safra yolları Kanalizasyona, küçük-bağırsak her iki tarafta bir hemostat kelepçe yerleştirin.
4. Pankreas, safra kesesi başlayan, safra yolları, 3 ml soğuk kollajenaz çözüm içeren bir 30g iğne ve 5 ml şırınga yoluyla şişirin.
5. Pankreas vücuttan çıkarın ve 2 ml kollajenaz çözüm içeren bir silikonlu flakon içine koyun. Bu adım, yağ ve bağ dokusu toplama en aza indirerek, hızlı ve mümkün olduğu kadar temiz olmalıdır .
6. Sonraki fare ile buz ve 3. adımı yineleyin Flakon yerleştirin.

Sindirim

1. Her flakon Seal ve 37 ° C su banyosu içine yerleştirin. 13-17 dakika (zaman gerginlik ve hayvanın yaşı ile değişir) inkübe edin.
2. Süre geçtikten sonra, şiddetle flakon sallayın. Pankreas ayrı düşmek gerekir.
3. 1000 ml steril bir beher içine büyük bir steril lavabo süzgeç vasıtasıyla her sindirmek dökün ve zorla yıkama tamponu ile ekran pipetle. Uygulama 50 ml conicals tüpler içine sindirir (3 pancreata/50 ml tüp: n = 12, son hacim 200 ml ve 4x50 ml tüpler dağıtmak için tampon yıkama yeterli kullanın). Seyreltme istenmeyen adacık sindirim önlemek için buz üzerinde ve hızla yapılmalıdır.
4. Spin: santrifüj Başlat. 1300 rpm ulaştığında, kapatın.
5. ~ 5 mL bırakarak, süpernatant aspire. Pelet aspire çok dikkatli olun.
6. Süspanse edin pelet şiddetle elinizle dokunarak, sonra 50 ml yıkama tamponu ekleyin.
7. Spin: santrifüj Başlat. 1300 rpm ulaştığında, kapatın.
8. Pelet ve yıkama 5 ml yıkama tamponu ile tekrar
9. 5 ml 15 ml konik transferi ve yukarıdaki gibi, aşağı doğru döndürün.
10. Süpernatantı mümkün olduğu kadar tamamen aspire. (Kalan tampon Ficoll yoğunluğu değişiklik neden olabilir.)

Ficoll

Hızlı gerçekleştirin. Uzun vadeli Ficoll maruz adacıklar için ZEHİRLİ.

1. Pelet tamamen Ficoll (kesintisiz doku Ficoll tekrar süspansiyon için zor) eklemeden önce kırık emin olun.
2. Şiddetle vorteks Ficoll, yoğunluğu 1.108, 7 ml pelletini tekrar.
3. 1.096, 1.069, ardından 1.037: bu sırada kalan yoğunluklarının her Ficoll 2ml her yoğunluğu üst katman.
4. KAPALI break ile 4 derece 15 dakika 1800 rpm'de döndür!
5. Spoid (steril p kullanarak ikinci kat adacıklar seçinLastic damlalık). Transfer tüm koleksiyonları, soğuk tampon 50 ml konik içeren ~ 25 ml.
6. Yıkama tamponu (adım 12-15 tekrar), yukarıdaki gibi, 3 kere yıkayın.
7. Içinde süspanse edin Islets 20 ml RPMI-1640 (% 10 FCS ve penisilin ve streptomisin, Hepes, MEM-NEAA içeren) ve hafifçe karıştırın. Sayımı için örnek 100 ul çıkarın.
8. 1 ml 1 ml dithizone medya ve içeren 35 mm Izgara plakası 100 ul aktarın.
9. Medya / plaka 30 ml toplam 160 mm plakalar, 37 ° C,% 7 CO ₂ kuvöz, RPMI 1640 içerisinde kalan adacıklar inkübe edin.
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal