Summary
Быстрый, надежный способ выделения жизнеспособных взрослых эпителиальных стволовых клеток из человеческой кожи описана. Метод использует ферментативного переваривания кожи матрицу коллагена, а затем выщипывание волосяных фолликулов и изоляции одного суспензии клеток или тканей фрагментов для клеточных культур.
Abstract
Гомеостаз всех самообновлению тканей зависит от взрослых стволовых клеток. Как недифференцированные стволовые клетки претерпевают асимметричной отделов, они создают дочерние клетки, которые сохраняют фенотип стволовых клеток и транзита усиливающих клетки (Т. А. клетки), которые мигрируют из ниши стволовых клеток, претерпевают быстрое распространение и неизлечимо дифференцироваться в населить ткани.
Эпителиальные стволовые клетки были идентифицированы в эпидермис, волосяной фолликул, и кишечника, как клетки с высокой в пробирке пролиферативный потенциал и, как езда на велосипеде медленно этикеткой сохранив клетки в естественных условиях 1-3. Взрослый, тканеспецифические стволовые клетки отвечают за регенерацию тканей, в которых они проживают во время нормального физиологического оборота, а также во время стресса 4-5. Более того, стволовые клетки, как правило, считаются мульти-мощный, обладающий способностью приводить к нескольким типам клеток в ткани 6. Например, грызунов волосковых клеток фолликула стволовых может генерировать эпидермиса, сальных желез и волосяных фолликулов 7-9. Мы показали, что стволовые клетки из человеческой области фолликула волоса выпуклость выставке мульти-потенциальность 10.
Стволовые клетки стали ценным инструментом в области биомедицинских исследований, из-за их полезности, как в пробирке системы для изучения биологии развития, дифференциации, опухолей и для их возможной терапевтической полезности. Вполне вероятно, что взрослые стволовые клетки эпителия будут полезны в лечении таких заболеваний, как эктодермального дисплазии, monilethrix, Нетертон синдром, Менкес заболевания, наследственные эпидермолиз буллезной и alopecias 11-13. Кроме того, другие проблемы кожи, такие как ожоговых ран, хронических ран и язв извлекут выгоду из стволовых клеток, связанных лечения 14,15. Учитывая возможность перепрограммирования взрослых клеток в плюрипотентные состоянии (IPS клетки), 16,17, легко доступной и расширяемой взрослых стволовых клеток в коже человека могут предоставить ценный источник клеток для индукции и вниз по течению терапии широкого спектра заболеваний, включая сахарный диабет и болезнь Паркинсона.
Protocol
1. Извлечение Эпителиальные стволовые клетки из человеческой кожи
- Перед началом процедуры выделения эпителиальных стволовых клеток нужно подготовить соответствующие СМИ и реагентов (см. табл.1).
- Свежий взрослого человека кожи головы от подтяжки лица процедуры или биопсии собирается, то инкубировать в DMEM / 10% FBS / Dispase (4 мг / мл) в течение ночи при температуре 4 ° C. Инкубация в течение 2-4 часов при температуре 37 ° С, также эффективны. Кожа части должны быть максимальной шириной 1 см, чтобы обеспечить фермента проникнуть.
- Передача кожу в стерилизованные чашки Петри, снять каждый волос с поверхности кожи, держа волос возле поверхности кожи и потянув твердо и гладко. Выберите фолликулы в телоген этапе на основе их морфологии при вскрытии микроскоп, вырезать выпуклости области (рис. 1А) передача фолликулов в 15 мл стерилизованной трубки. Анаген фолликулов также может быть использована, если вырезать в верхней 1 / 3 от фолликула получить волосяной фолликул «вздутие» региона (рис. 1В).
- Инкубируйте изолированные фрагменты фолликула в смеси 0,05% трипсина-EDTA (Gibco) и версен (0,53 мМ ЭДТА 4Na, GIBCO) (1:1) в течение 15-20 минут при комнатной температуре при встряхивании периодически, добавить 4 мл DMEM + 10 % FBS, чтобы остановить реакцию, спином вниз в течение 5 мин при 800 оборотах в минуту. Кроме того, фолликул эксплантов фрагмент ткани могут быть помещены в культуру без трипсина переварить в культуре клеток из одного фолликула.
- Удалите супернатант тщательно (за исключением ~ 0,2-0,5 мл, чтобы избежать потери клеток) и повторно приостанавливать в 1 мл КСМ (кератиноцитов среды), без EGF.
2. Первичные культуры эпителиальных стволовых клеток
- Перед культивирования эпителиальных стволовых клеток, митомицин С обработанных 3T3-J2 клеток (фидерных клеток) должен быть подготовлен в следующем. 3T3-J2 клетки культивируют в DMEM с 10% FBS до начала лечения. Удалить культивирования СМИ и мыть ячейки в два раза с PBS, лечить ячейки с 15μg / мл митомицин С в DMEM без сыворотки в течение 2 часов при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Удалить митомицин C-содержащих DMEM и мыть два раза PBS, клетки готовы к использованию. (Митомицин С обработанных 3T3-J2 клетки могут быть также получены ранее и хранится при температуре -80 ° С. Оттепель и семенной клетки за один день до культивирования первичных эпителиальных стволовых клеток, инкубируют при 37 ° C, 5% СО 2. 150,000-200,000 3T3-J2 клеток на лунку в 6-луночного планшета рекомендуется.
- Семенной изолированных волосяных фолликулов стволовых клеток из шага 1.5 на митомицин С обработанных 3T3-J2 клеток в КСМ без EGF ночи при 37 ° C, 5% СО 2, изменено на ЭФР-содержащих КСМ на следующий день. Клетки выращивали при 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% СО 2. Все кератиноцитов кормят КСМ содержащих ЭФР каждые 2 дня и выращивают в течение 14-20 дней. Проверка ячейки каждый день под микроскопом. Волосы клетках фолликулов стволовых будет образовывать колонии (рис. 2А). Эксплантов волосяного фолликула образует выросты через 10-14 дней (рис. 2В).
3. Прохождение эпителиальных стволовых клеток
- Вымойте клеток с PBS один раз. Удалить 3T3-J2 фидерные клетки путем версен (предварительно нагревают до RT) лечения. Инкубируйте культуру выпуклые в версен в течение 5 минут, затем аккуратно встряхнуть и аспирации от фидерных клеток.
- Вымойте волосы клетках фолликулов стволовых либо версен или PBS один раз.
- Добавить подогретого (до 37 ° С, критическое) трипсина-EDTA (2Х) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 7 минут или дольше, если необходимо для стволовых волосяной фолликул ячейки необходимо отсоединить. Не более 15 минут, тем лучше.
- Добавить КСМ без EGF, чтобы остановить трипсина, мягко пипетку вверх и вниз, чтобы разогнать клетки, спина вниз на 200 г, 5 минут.
- Повторное приостановить клетки с КСМ без EGF, граф и повторно пластину на митомицин С обработанных 3T3-J2 слой клеток.
4. Увековечению эпителиальных стволовых клеток
Первичные элементы, даже взрослые стволовые клетки, достигают старения после серийного пассажа и месяцы в культуре. Увековечению первичных стволовых клеток является эффективным способ снять эту проблему.
- Пластина первичных эпителиальных стволовых клеток (~ 350 000 клеток / лунку в 6-луночный планшет) при прохождении 1 на фидерного слоя (3T3-J2) и культуры в течение 2 дней.
- Культура PA317 LXSN 16E6E7 клеточной линии в один прекрасный день после посева первичных эпителиальных стволовых клеток с DMEM, содержащей 10% FBS. (Эта линия выпускает amphotropic LXSN16E6E7 ретровирус, который кодирует HPV16 Е6 и Е7 открытые рамки считывания, и которые могут быть использованы для стабильно заразить и увековечить многих типов клеток).
- Лечить PA317 LXSN 16E6E7 клеточной линии митомицином С в течение 2 часов (тот же протокол с 3T3-J2 клеток). Добавить митомицин С рассматриваться PA317 LXSN 16E6E7 клеточной линии для первичной эпителиальных стволовых клеток, со-культуры в течение 6 дней в КСМ с ЭФР. Renew свежие КСМ с ЭФР СМИ каждые 2 дня.
- Удалить 3T3-J2 и PA317 LXSN 16E6E7 ячейки с версен. Добавить митомицин-С лечение 3T3-J2 NHP клеток (неомицин, гигромицину, пуромицин устойчивы, ~ 200 000 клеток на лунку) на эпителиальных стволовых клеток. Клетки отобранных по 0,2 мг / мл G418 (Gibco) дополненийitional 6 дней. Renew свежие G418 содержащие КСМ с ЭФР СМИ каждые 2 дня.
Выжившие эпителиальных стволовых клеток будут увековечены стволовых клеток. Также первичных эпителиальных стволовых клеток, которые не являются со-культивировали с PA317 LXSN 16E6E7 ячейка должна быть установлена в качестве контроля для выбора G418, все клетки в этот колодец должен быть убит G418 через 6 дней после определения.
5. Представитель Результаты
Ранний переход кожи эпителиальных стволовых клеток и увековечил эпителиальных стволовых клеток образовывать тесные колониях, состоящих из небольших кератиноцитов (рис. 2А), окруженный фидерных клеток. Если культивировали в сыворотке свободных средств массовой информации с определенными добавками, без фидерного слоя, стволовые клетки смогут разойтись и не образуют плотный колонии (они растут, как отдельных клеток и небольших кластеров). Иммортализованные эпителиальных стволовых клеток поддерживать стабильный фенотип для> 12 месяцев непрерывного прохода, но, как правило жесткие формы колоний, чем первичные клетки. Они не образуют якорную стоянку независимые колонии в мягком агаре тесты, показывая, что эти увековечены клетки не обладают характеристиками раковых клеток. Первичный и увековечил эпителиальных стволовых клеток волосяного фолликула выразить стволовых клеток маркера цитокератин 15 (рис. 3А), и способны дифференцироваться в эпидермис, волосяной фолликул и сальных линий (рис. 3Б-D).
Рисунок 1. Plucked волосков. После выщипывания от dispase обработанной кожи, волосяного фолликула появляется либо как телоген волосков клуба () с шаром клеток, окружающих нижнюю часть волос, или анагена волосы (В) с рукавом эпителия окружающих длине волос. Регион телоген выпуклости формы различных морфологических области микро-рассекают, а выпуклость анаген менее различны. Луковица анаген содержит матрицу кератиноциты, представляющие транзит-усилительных клетки, которые также могут быть выделены и культурно.
Рисунок 2. Стволовые клетки культур. (А) Эпителиальные стволовые клетки из кожи образовывать тесные эпителиальных колоний (назначенные E) при культивировании в КСМ с фидерного слоя клеток (назначенные F). (B) эксплантов волосяного фолликула приводит к эпителиальных выростов. Регион телоген выпуклость (назначенные T) прилагается к блюду и окружен эпителиальными клетка колонии вместе с фидерных клеток.
Рисунок 3. Стволовых клеток дифференциации. (А) Стволовые клетки колонии поддерживать выражение эпителиальных маркеров, таких как цитокератин 15. (В) кожи эпителиальных стволовых клеток могут быть дифференцированы по линии волосяного фолликула, как определяется выражением K6Hf. (C) клетки можно культивировать на де-epidermalized дермы или других матриц на воздух-жидкость и станет стратифицированной эпидермиса с рогового слоя, зернистого слоя и остистых слоя. (D) Стволовые клетки могут быть вызваны по сальных линии с нефтью Красной положительные глобул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клетка добычи и культуры методов, описанных на удивление легкий и воспроизводимыми. Мы сформировали эпителиальный культур стволовых клеток из десятков лиц в широком возрастном диапазоне, включая пациентов с наследственными дефектами кожи 18. Лучше всего, чтобы начать процесс в тот день, ткани урожая, однако клетки остаются жизнеспособными в средствах массовой информации на льду в течение нескольких дней, что облегчает доставку ночью, если потребуется. Выкинуть подтяжку лица кожей приводит сотни жизнеспособных фолликулов для сотовых добычи как отдельные суспензии клеток. Для более ограниченным ткани, например, от биопсии кожи головы, эксплантов культуры могут быть более эффективными, так как есть меньше шансов на потерю клеток в трипсинизации и центрифугирования. Для эксплантов культур, наиболее важным аспектом является прикрепление фрагмент ткани, чтобы блюдо. Добавление небольшого количества СМИ только покрытие ткани и минимальной манипуляцией рекомендуется до наросты появляются через 10-14 дней.
Взрослый эпителиальных стволовых клеток из кожи могли бы широкое применение. Культивированных клеток кожи уже находятся в клиническом применении для ожоговых больных и хронических ран. Задача сейчас стало создание лучшей кожи эквивалентны потовые железы и волосы. Потенциал использования стволовых клеток кожи для волос регенерации захватывающие возможности.
Как упоминалось ранее, способность вызывать первобытное состояние плюрипотентных клеток взрослого организма в представляет собой значительный прогресс для потенциальных ячейки терапии на основе без использования эмбриональных стволовых клеток 16,17. Однако этот процесс является неэффективным и потенциально онкогенные, так как вирусные векторы, которые используются, чтобы вызвать экспрессию генов стволовых клеток. Если начать с взрослого населения стволовых клеток, это может значительно увеличить эффективность и исключить необходимость в стабильной вирусной трансфекции, чтобы побудить плюрипотентности. Трансплантация стволовых клеток костного мозга была использована в качестве ячейки подход для лечения тяжелых заболеваний кожи, таких как эпидермолиз буллезной. 19,20 Кроме того, коррекция коллагена 7 дефект эпидермолиз буллезной был достигнут в кератиноциты пациента в лабораторных условиях. 21 Выделение эпителиальных стволовых клеток из кожи биопсия может предоставить ресурсы для расширения на этой ранней работе и развивать индивидуальную терапию ячейку с помощью аутологичных клеток.
Интересно, что выпуклости волосяной фолликул регион является также местом других взрослых стволовых клеток / предшественников бассейны клетки. Сюй и др. 22. Выявила мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток из этого региона. Меланоцитов прекурсорами, также проживает в волосах выпуклость 23. Таким образом, изоляция волосяной фолликул метод, представленный здесь может быть легко адаптирована для изоляции этих других типов клеток для дальнейших экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансируется NIH / NCI грант R01CA-118916
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
References
- Jones, P. H., Watt, F. M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73, 713-724 (1993).
- Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).
- Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm. Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).
- Slac, J. M.
- It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11, 1351-134 (2005).
- Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell. 102, 451-461 (2000).
- Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell. 104, 233-245 (2001).
- Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In vitro Cell. & Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).
- Ohyama, M., Vogel, J. C. G. ene
- Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system. Gene Ther. 13, 732-737 (2006).
- Stenn, K. S., Cotsarelis, G. Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology. Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).
- Hoeller, D. An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10. , 264-271 (2001).
- Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra). Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).
- Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH. Science. 314, 982-985 (2006).
- Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells. Blood. 113, 1167-1174 (2009).
- Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).
- Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa. J Invest Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science. 307, 720-724 (2005).
