Summary
隔离可行的成人上皮干细胞的人体皮肤快速，可靠的方法是描述。该方法利用酶消化，皮肤胶原质基质，毛囊和隔离的单细胞悬液或细胞培养的组织碎片采摘。
Abstract
所有组织自我更新的动态平衡，是依赖于成人干细胞。由于未分化的干细胞进行不对称分裂，它们所产生的子细胞，保留干细胞表型和过境扩增细胞（助教细胞），移植的干细胞小生境，进行快速增殖和晚期分化重新填充组织。
在表皮，毛囊和肠上皮干细胞已被确定为细胞在体外增殖潜能高，慢骑自行车的标签保留细胞在 体内 1-3 。成年后，组织特异性干细胞再生的组织在其居住，在正常的生理营业额，以及在压力4-5倍。此外，干细胞一般认为是多有力，拥有的能力上升到多种类型的细胞内组织6。例如，啮齿类动物毛囊干细胞可以生成表皮，皮脂腺和毛囊7-9。我们已经表明，从人类毛囊隆起地区干细胞表现出多潜能 10 。
干细胞已经成为在生物医学研究的宝贵工具，由于其作为体外研究发育生物学，分化，肿瘤的发生和其可能的治疗用途的系统实用工具。成人上皮干细胞很可能将在如外胚层发育不良，monilethrix，瑟顿综合征，Menkes病，遗传性大疱性表皮松解症和alopecias 11-13等疾病的治疗非常有用。此外，如烧伤，慢性伤口和溃疡等皮肤问题，将有利于干细胞相关治疗 14,15 。鉴于潜在的成年细胞重新编程为国家多能干（iPS细胞）16,17，可以提供方便和可扩展的成人干细胞在人体皮肤细胞诱导和下游治疗的疾病范围广泛，包括一个非常宝贵的资源糖尿病和帕金森氏病。
Protocol
1。从人体皮肤中提取的上皮干细胞
- 开始之前隔离上皮干细胞的过程，需要准备各自的媒体和试剂（见表1）。
- 收集新鲜成人换装程序或打孔活检人类头皮，然后孵化的DMEM / 10％FBS / Dispase（4毫克/毫升）一夜之间在4 ° C。潜伏期为2-4小时，在37 ° C也是有效的。皮肤件应为1厘米，最大宽度允许酶渗透。
- 消毒的培养皿转移到皮肤，从皮肤拉断每个头发抓住附近的皮肤表面发干，拉动坚决和顺利。选择基于他们在解剖显微镜下的形态休止阶段的卵泡，切出的凸起区域（图1A）转移卵泡到15毫升的消毒管。生长期毛囊也可以用来切上部1 / 3的卵泡，如果获得毛囊“隆起”的地区（图1B）。
- 孵育15-20分钟，在室温下晃动定期在0.05％胰酶- EDTA（GIBCO）和Versene（0.53毫米EDTA 4Na，GIBCO公司）（1:1）混合的孤立的卵泡片段，添加4毫升的DMEM + 10 ％胎牛血清停止反应，5分钟800转的旋转。此外，毛囊组织片段植可以放在没有胰蛋白酶消化，从单一的毛囊细胞培养文化。
- 弃上清小心（〜0.2-0.5毫升保存，以避免失去细胞），并重新暂停在1毫升KCM公司（角质形成细胞的培养基），无表皮生长因子。
2。文化小学的上皮干细胞
- 前培养的上皮干细胞，丝裂霉素C - 3T3 - 6300320细胞（饲养层细胞），应准备如下处理。 3T3 - 6300320细胞培养的DMEM与10％FBS治疗前。删除培养媒体，用PBS洗细胞两次，治疗与15μg/ mL的丝裂霉素C的DMEM无血清在2小时37 ° C，5％的CO 2的细胞。删除丝裂霉素C的DMEM，用PBS洗两次，细胞已经准备好使用。 （丝裂霉素C处理的3T3 - 6300320细胞还可以准备以前保存于-80 ° C.解冻和种子细胞培养初级上皮干细胞前一天，于37孵育℃，5％的CO 2。 150,000-200,000 6孔板，每孔细胞3T3 - 6300320建议。
- 步骤1.5种子孤立毛囊干丝裂霉素细胞的C - KCM公司3T3 - 6300320细胞没有表皮生长因子在37℃过夜治疗℃，5％CO 2，含有表皮生长因子- KCM公司改为第二天。细胞是生长在37 ° C在潮湿的大气中含有5％的CO 2 。所有的角质形成细胞是美联储含有表皮生长因子与KCM公司每2天，并成长为14-20天。每天检查细胞在显微镜下。毛囊干细胞会形成菌落（图2A）。毛囊植后，将形成10-14天（图2B）的副产物。
3。通道上皮干细胞
- 用PBS洗涤细胞一次。卸下Versene（预热至RT）治疗饲养层细胞3T3 - 6300320。孵育文化Versene抛出5分钟，然后轻轻摇动和吸饲养层细胞。
- 毛囊干细胞Versene或PBS一次清洗。
- 加入预热（至37 ° C，临界）胰蛋白酶- EDTA（2X），并在37 ° C时7分钟或更长的时间，必要时对毛囊干细胞的分离。最长不超过15分钟是最好的。
- 添加KCM公司W / O型表皮生长因子，以阻止胰蛋白酶，轻轻吸管分散细胞，在200克旋转下来，5分钟。
- 与KCM公司暂停细胞无表皮生长因子，计数和丝裂霉素C处理的3T3 - 6300320细胞层上的重制版。
4。不朽上皮干细胞
原代细胞，甚至成人干细胞，达到串行通道和文化个月后的衰老。基层干细胞永生化是一种有效的的方式来缓解这个问题。
- 板小学在饲养层上的1通过上皮干细胞（3T3 - 6300320）（〜35万细胞/ 6孔板）和2天的文化。
- 文化PA317 LXSN 16E6E7细胞株有一天播种后用DMEM含10％胎牛血清的主要上皮干细胞。 （此生产线生产amphotropic的逆转录病毒LXSN16E6E7编码的HPV16型E6和E7开放读码框架，可用于稳定感染和不朽多种细胞类型）。
- 治疗2小时，用丝裂霉素C（3T3 - 6300320细胞相同的协议）LXSN 16E6E7 PA317细胞系。加丝裂霉素C治疗PA317 LXSN 16E6E7细胞株主上皮干细胞，共培养6天与表皮生长因子KCM公司。与表皮生长因子媒体续订新鲜KCM公司每2天。
- 删除3T3 - 6300320 16E6E7 LXSN PA317细胞与Versene。添加丝裂霉素C处理3T3 - 6300320 NHP细胞（新霉素，潮霉素，嘌呤霉素抗性〜20细胞，每孔）的上皮干细胞。细胞被选中下添加0.2毫克/毫升的G418（GIBCO）itional 6天。续订与EGF媒体每隔2天的新鲜G418包含KCM公司。
尚存的上皮干细胞将是永生的干细胞。不PA317 LXSN 16E6E7细胞共同培养的主上皮干细胞的井应设置控制G418筛选，在这口井的所有细胞被杀死后经G418选择6天。
5。代表性的成果
通过皮肤上皮干细胞和永生化上皮干细胞的早期形式组成严密的殖民地饲养层细胞包围的小角质形成细胞（图2A）。如果在无饲养层，无血清媒体定义的补充的培养，干细胞会分散，不能形成紧殖民地（他们成长为单个细胞和小群）。永生上皮干细胞的维持稳定的表型为12个月的连续传代，但往往比主细胞形成更紧密的殖民地。他们没有形成锚地独立的殖民地，在软琼脂实验表明，这些永生细胞所不具备的特点癌细胞。小学和永生化上皮干细胞表达毛囊干细胞标记的细胞角蛋白15（图3A），并能分化成表皮，毛囊和皮脂腺的谱系（图3B - D）。
图1。弹拨的毛发。 dispase治疗皮肤采摘后，毛囊会出现一个细胞周围的头发底部球无论是俱乐部的休止期头发（一）或（B）与上皮细胞周围的头发长度的袖子生长期毛发。休止期隆起地区形成了一个独特的微解剖形态学地区，而生长期隆起明显。生长期灯泡包含矩阵角质形成细胞，占过境放大，也可以分离和培养的细胞。
图2干细胞培养。 （一）上皮干细胞，从皮肤形成紧上皮殖民地（通过电子邮件指定）时，KCM公司培养的饲养层细胞（由F指定）。 （二）毛囊植，引起上皮的副产物。休止期隆起地区（指定由T）连接到的菜和上皮细胞集落一起饲养层细胞包围。
图3。干细胞的分化。 （一）干细胞群，维持上皮标志物如细胞角蛋白15的表达。 （二）皮肤上皮干细胞可分化K6Hf表达确定的沿毛囊血统。 （三）被培养的细胞可以去epidermalized真皮或其他矩阵在气 - 液界面上，将形成一个与分层表皮角化层，颗粒层，棘层。 （四）干细胞可诱导沿油红积极球皮脂腺血统。
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Discussion
细胞的提取和培养方法是惊人的轻便和可重复性。我们产生了几十个人在广泛的年龄范围，包括遗传性皮肤缺损18患者的上皮干细胞培养。最好是组织收获的一天开始的过程，但是细胞会继续生存在冰上媒体好几天了，如果需要，促进通宵航运。弃置换装皮肤产生数百个可行的毛囊细胞提取单细胞悬液。对于更有限的组织，如冲床从头皮活检，，外植体的文化可能会更有效，因为细胞胰酶消化，离心损失的机会较少。对于外植体培养，最重要的是菜的组织片段的附件。除了媒体的小金额，只是覆盖的组织和最小操纵的是建议在10-14天，直到副产物出现。
成人皮肤的上皮干细胞可能具有广泛的应用。培养的皮肤细胞已经在烧伤患者和慢性伤口的临床应用。现在的挑战已经成为创造一个更好的皮肤汗腺和毛发相当于的。毛发再生的皮肤干细胞的潜在用途是令人兴奋的可能性。
如前所述，在成年细胞能够诱导一种原始的多能干状态代表一个潜在的细胞为基础的疗法，没有利用胚胎干细胞 16,17显着的进步。然而，这个过程是低效的和潜在的致癌性，因为病毒载体用于诱导干细胞基因的表达。如果一个成人干细胞的人口开始，它可以大大提高工作效率和稳定的病毒转染诱导多能性，无须。利用骨髓干细胞移植已经作为一个细胞为基础的的方法来治疗严重的皮肤疾病，如大疱性表皮松解 。19,20此外，胶原7大疱性表皮松解缺陷的修正已在病人的角质形成细胞在体外实现。21从皮肤活检上皮干细胞的分离，可提供资源，以扩大在此以前的工作，并制定个性化的细胞疗法，采用自体细胞。
有趣的是，毛囊隆起地区也是网站的其他成人干细胞/祖细胞池。许志琴等 22个已经确定从本地区的多能间质干细胞。黑素细胞的前体，也驻留在头发隆起 23 。因此，隔离的方法，这里介绍的毛囊可以很容易地适应隔离这些其他类型的细胞，为进一步的实验。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由NIH / NCI资助R01CA - 118916
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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