Summary
Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.
Abstract
L'omeostasi di tutti i tessuti e auto-rigenerante dipende da cellule staminali adulte. Mentre le cellule staminali indifferenziate subire divisioni asimmetriche, che generano cellule figlie che mantengono il fenotipo delle cellule staminali e di transito-amplificazione cellule (cellule TA) che migrano dalla nicchia delle cellule staminali, subiscono rapida proliferazione e differenziazione terminale per ripopolare il tessuto.
Le cellule staminali epiteliali sono state identificate nell'epidermide, follicolo pilifero, e intestino come cellule con un alto potenziale proliferativo in vitro e come slow-ciclismo-label mantenendo le cellule in vivo 1-3. Adulti, tessuto-specifiche cellule staminali sono responsabili della rigenerazione dei tessuti in cui risiedono durante il normale turnover fisiologico, così come durante periodi di stress 4-5. Inoltre, le cellule staminali sono generalmente considerati più potenti, che hanno la capacità di dare origine a più tipi di cellule all'interno del tessuto 6. Per esempio, roditori cellule staminali dei follicoli dei capelli in grado di generare epidermide, ghiandole sebacee e follicoli piliferi 7-9. Abbiamo dimostrato che le cellule staminali dall'umano regione rigonfiamento follicolo pilifero mostra multi-potenzialità 10.
Le cellule staminali sono diventate uno strumento prezioso nella ricerca biomedica, per la loro utilità come un sistema in vitro per lo studio della biologia dello sviluppo, la differenziazione, tumorigenesi e per la loro possibile utilità terapeutica. E 'probabile che le cellule staminali epiteliali adulte sarà utile nel trattamento di malattie come la displasia ectodermica, monilethrix, Netherton sindrome, malattia di Menkes, epidermolisi bollosa ereditaria e alopecia 11-13. Inoltre, altri problemi della pelle come ad esempio ustioni, ferite e le ulcere croniche potranno beneficiare di terapie con cellule staminali legate 14,15. Dato il potenziale per la riprogrammazione delle cellule adulte in uno stato pluripotenti (cellule iPS) 16,17, il facilmente accessibile ed espandibile cellule staminali adulte di pelle umana può fornire una preziosa fonte di cellule per la terapia di induzione e a valle per una vasta gamma di malattie tra cui diabete e morbo di Parkinson.
Protocol
1. Estrarre cellule staminali epiteliali da pelle umana
- Prima di iniziare la procedura di isolare le cellule staminali epiteliali si ha la necessità di preparare i rispettivi media e reagenti (vedi tabella 1).
- Fresco la pelle del cuoio capelluto umano adulto da procedure lifting o biopsia viene raccolto, incubare in FBS DMEM / 10% / dispasi (4 mg / ml) durante la notte a 4 ° C. Incubazione per 2-4 ore a 37 ° C è anche efficace. Pezzi di pelle deve essere una larghezza massima di 1 cm per consentire enzima per penetrare.
- Trasferire la pelle in una capsula di Petri sterile, tirare fuori di ogni capello dalla pelle afferrando il fusto del capello vicino alla superficie della pelle e tirando con fermezza e senza intoppi. Seleziona follicoli in fase telogen in base alla loro morfologia sotto un microscopio da dissezione, tagliare la regione rigonfiamento (Figura 1A) follicoli trasferimento in un tubo da 15 ml sterilizzati. Follicoli anagen può essere utilizzato anche se tagliato in alto a 1 / 3 del follicolo per follicolo pilifero ottenere regione "bulge" (Figura 1B).
- Incubare i frammenti follicolo isolato in una miscela di 0,05% tripsina-EDTA (GIBCO) e Versene (0,53 mM EDTA 4NA, GIBCO) (1:1) per 15-20 minuti a temperatura ambiente agitando periodicamente, aggiungere 4 ml di DMEM + 10 % FBS per fermare la reazione, spin down per 5 min a 800 giri al minuto. In alternativa, follicolo espianti frammento di tessuto può essere collocato in cultura senza tripsina digerire alle cellule dai follicoli singola cultura.
- Gettare il surnatante con cura (salvo ~ 0,2-0,5 mL per evitare di perdere le cellule) e risospendere in 1 ml KCM (media dei cheratinociti), senza FEG.
2. Cultura pile staminali epiteliali
- Prima di coltura le cellule staminali epiteliali, mitomicina C trattati con 3T3-J2 cellule (cellule di alimentatore) deve essere preparato come segue. 3T3-J2 cellule sono coltivate in DMEM con FBS 10% prima del trattamento. Rimuovere i supporti coltura delle cellule e lavare due volte con PBS, il trattamento delle cellule con 15μg / mL mitomicina C in DMEM senza siero per 2 ore a 37 ° C, 5% CO 2. Rimuovere la mitomicina C contenenti DMEM e lavare due volte con PBS, le cellule sono pronte all'uso. (Mitomicina C trattati con 3T3-J2 cellule possono anche essere preparati in precedenza e conservati a -80 ° C. Scongelare e semi di cellule un giorno prima che la coltura delle cellule staminali epiteliali primarie, incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. 150.000-200.000 3T3-J2 cellule per pozzetto della piastra 6-bene è raccomandato.
- Semi isolato cellule dei follicoli dei capelli staminali a partire dal punto 1.5 in mitomicina C trattati con 3T3-J2 cellule KCM senza pernottamento FEG a 37 ° C, 5% di CO 2, cambiata EGF contenenti KCM il giorno successivo. Le cellule sono coltivate a 37 ° C in atmosfera umida contenente il 5% di CO 2. Tutti i cheratinociti sono alimentati con KCM contenente FEG ogni 2 giorni e coltivate per 14-20 giorni. Controllare ogni giorno cellula al microscopio. Capelli cellule staminali del follicolo si forma colonie (Figura 2A). Espianti follicolo si forma escrescenze dopo 10-14 giorni (Figura 2B).
3. Passaggio cellule staminali epiteliali
- Lavare le cellule con PBS una volta. Rimuovere le cellule 3T3-J2 alimentatore da Versene (pre-riscaldato a RT) del trattamento. Cultura incubare bombati in Versene per 5 minuti, poi agitare delicatamente ed aspirare le cellule di alimentazione.
- Lavare i capelli con le cellule staminali del follicolo sia Versene o PBS una sola volta.
- Aggiungi pre-riscaldato (a 37 ° C, critici) tripsina-EDTA (2X) e incubare a 37 ° C per 7 minuti o più, se necessario, per le cellule staminali dei follicoli dei capelli di staccarsi. Non più di 15 minuti è il migliore.
- Aggiungi KCM w / o FEG per fermare la tripsina, pipettare delicatamente su e giù per disperdere le cellule, spin down a 200g, 5 minuti.
- Risospendere le cellule con KCM senza EGF, il conte e ri-piastra su mitomicina C trattati con 3T3-J2 strato di cellule.
4. Immortalare cellule staminali epiteliali
Pile, di cellule staminali adulte, anche, raggiungere senescenza dopo il passaggio di serie e mesi in coltura. Immortalizzazione di cellule staminali primarie è un modo efficace per alleviare questo problema.
- Piastra primaria cellule staminali epiteliali (~ 350.000 cellule / pozzetto di 6 pozzetti) al passaggio 1 su strato alimentatore (3T3-J2) e la cultura per 2 giorni.
- Cultura PA317 LXSN 16E6E7 linea di cellule un giorno dopo la semina delle cellule staminali epiteliali primarie con DMEM contenente 10% FBS. (Questa linea produce il LXSN16E6E7 amphotropic retrovirus che codifica per l'HPV16 E6 ed E7 open reading frame, e che può essere utilizzato per infettare in modo stabile e immortalare molti tipi di cellule).
- Trattare PA317 LXSN 16E6E7 linea cellulare con mitomicina C per 2 ore (stesso protocollo con 3T3-J2 cellule). Aggiungi mitomicina C trattati PA317 LXSN 16E6E7 linea cellulare di cellule staminali epiteliali primarie, co-coltura per 6 giorni in KCM con EGF. Rinnova KCM fresco con EGF i media ogni 2 giorni.
- Rimuovere 3T3-J2 e PA317 LXSN 16E6E7 cella con Versene. Aggiungi mitomicina-C trattati 3T3-J2 cellule NHP (neomicina, Hygromycin, puromicina resistente, ~ 200.000 cellule per pozzetto) per le cellule staminali epiteliali. Le celle sono scelti nell'ambito 0,2 mg / ml di G418 (Gibco) per aggiungereitional 6 giorni. Rinnovare fresca KCM G418 contenente con EGF i media ogni 2 giorni.
Sopravvivere cellule staminali epiteliali saranno immortalate le cellule staminali. Un bene primario di cellule staminali epiteliali che non sono co-coltura con PA317 LXSN 16E6E7 cellula deve essere impostato come un controllo per la selezione G418, tutte le celle in questo bene dovrebbe essere ucciso da G418 dopo 6 giorni di selezione.
5. Rappresentante Risultati
Passaggio iniziale delle cellule staminali epiteliali della pelle e immortalata cellule staminali epiteliali formano colonie stretta costituita da cheratinociti di piccole dimensioni (Figura 2A), circondato da cellule nutrici. Se colta nel siero media liberi con supplementi definito, senza un livello di alimentazione, le cellule staminali si disperderà e non forma colonie stretto (crescono come celle singole e piccoli gruppi). Immortalato le cellule staminali epiteliali mantenere un fenotipo stabile per> 12 mesi di continuo passaggio, ma la tendenza a formare colonie più stretta rispetto alle cellule primarie. Essi non formano colonie di ancoraggio indipendente nei test di agar molle, indicando che queste cellule immortali non possiedono le caratteristiche delle cellule cancerose. Primaria e immortalato le cellule staminali epiteliali esprimere il follicolo pilifero marker delle cellule staminali citocheratina 15 (Figura 3A), e sono in grado di differenziarsi in epidermica, follicolo pilifero e lignaggi sebacee (Figura 3B-D).
Figura 1. Pizzico capelli. Dopo la spiumatura da dispasi trattati con la pelle, i follicoli dei capelli appaiono come sia capelli telogen club (A) con un ammasso di cellule che circonda la parte inferiore dei capelli, peli o di anagen (B) con un manicotto di epitelio che circonda la lunghezza dei capelli. La regione rigonfiamento telogen forma una regione distinta morfologico di micro-sezionare, mentre il rigonfiamento anagen è meno distinto. Il bulbo contiene anagen cheratinociti della matrice, che rappresenta transito amplificazione cellule che possono essere isolate e coltivate.
Figura 2. Cellule staminali culture. (A) le cellule staminali epiteliali dalla pelle forma colonie stretto epiteliali (designati da E), quando coltivate in KCM alimentatore con uno strato di cellule (designati da F). (B) espianti follicoli dei capelli dar luogo a escrescenze epiteliali. La regione rigonfiamento telogen (designato dal T) è attaccato al piatto e circondato colonia delle cellule epiteliali insieme con le cellule di alimentazione.
Figura 3. Differenziazione delle cellule staminali. (A) Le cellule staminali colonie mantenere espressione di marcatori epiteliali come citocheratina 15. (B) le cellule staminali epiteliali della pelle possono essere differenziati lungo il lignaggio follicolo pilifero come determinato dalla espressione K6Hf. (C) Le cellule possono essere coltivate in de-epidermalized derma o altre matrici all'interfaccia aria-liquido e formare una strato di epidermide stratificata con cornified, strato granuloso e strato spinoso. (D) Le cellule staminali possono essere indotte lungo il lignaggio sebacee con olio di globuli rossi positivo.
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Discussion
I metodi di estrazione delle cellule e la cultura descritti sono sorprendentemente facili e riproducibili. Abbiamo generato epiteliali colture di cellule staminali da decine di individui in una vasta gamma d'età, inclusi i pazienti con difetti della pelle ereditaria 18. E 'meglio iniziare il processo il giorno della raccolta dei tessuti, tuttavia cellule rimangono vitali nel multimediale su ghiaccio per diversi giorni, facilitando la spedizione notte, se necessario. Pelle lifting scartato rendimenti centinaia di follicoli vitali per l'estrazione delle cellule come sospensioni singola cellula. Per ulteriori tessuto limitata, come da una biopsia del cuoio capelluto, le culture espianto può essere più efficace, poiché ci sono meno possibilità di perdita di cellule nel tripsinizzazione e centrifugazione. Per le culture espianto, l'aspetto più importante è l'attaccamento del frammento di tessuto al piatto. L'aggiunta di piccole quantità di mezzi di comunicazione che copre appena la manipolazione dei tessuti e minimale è raccomandata fino escrescenze apparire in 10-14 giorni.
Cellule staminali epiteliali della pelle potrebbe avere una vasta applicazione. Cellule della pelle in coltura sono già in applicazione clinica di pazienti ustionati e ferite croniche. La sfida ora è diventata la creazione di un equivalente della pelle migliore con ghiandole sudoripare e dei capelli. L'utilizzo potenziale delle cellule staminali per la rigenerazione della pelle dei capelli è possibilità eccitante.
Come accennato in precedenza, la capacità di indurre uno stato primitivo delle cellule adulte in pluripotenti rappresenta un avanzamento significativo per terapie cellulari basate potenziale senza l'utilizzo di cellule staminali embrionali 16,17. Tuttavia, il processo è inefficiente e potenzialmente oncogeni, in quanto vettori virali sono utilizzati per indurre l'espressione dei geni delle cellule staminali. Se si inizia con una popolazione di cellule staminali adulte, può aumentare notevolmente l'efficienza e ovviare alla necessità di stabili trasfezioni virale per indurre la pluripotenza. Il trapianto di cellule staminali del midollo osseo è stato utilizzato come una cellula approccio per il trattamento di malattie cutanee gravi quali epidermolisi bollosa. 19,20 Inoltre, la correzione del difetto del collagene 7 in epidermolisi bollosa è stato raggiunto nei cheratinociti del paziente in vitro. 21 isolamento di cellule staminali epiteliali da una biopsia cutanea può fornire risorse per espandere su questo precedente lavoro e sviluppare terapie cellulari individualizzato utilizzando cellule autologhe.
È interessante notare che il follicolo regione capelli rigonfiamento è anche il sito di altri adulti di cellule staminali / progenitrici delle cellule piscine. Xu et al. 22 ha identificato le cellule staminali mesenchimali multipotenti da questa regione. Precursori dei melanociti risiedono anche nel rigonfiamento capelli 23. Così, il follicolo dei capelli isolamento metodo presentato qui può essere facilmente adattato per isolare questi altri tipi di cellule per ulteriori sperimentazioni.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è finanziato dal NIH / NCI concedere R01CA-118916
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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References
- Jones, P. H., Watt, F. M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73, 713-724 (1993).
- Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).
- Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm. Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).
- Slac, J. M.
- It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11, 1351-134 (2005).
- Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell. 102, 451-461 (2000).
- Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell. 104, 233-245 (2001).
- Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In vitro Cell. & Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).
- Ohyama, M., Vogel, J. C. G. ene
- Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system. Gene Ther. 13, 732-737 (2006).
- Stenn, K. S., Cotsarelis, G. Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology. Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).
- Hoeller, D. An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10. , 264-271 (2001).
- Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra). Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).
- Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH. Science. 314, 982-985 (2006).
- Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells. Blood. 113, 1167-1174 (2009).
- Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).
- Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa. J Invest Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science. 307, 720-724 (2005).
