Summary
人間の皮膚から実行可能な成人上皮幹細胞を単離の迅速、確実な方法が記載されている。方法は、毛包と細胞培養のための単一の細胞懸濁液または組織断片の分離の摘採が続く皮膚のコラーゲンマトリックスの酵素消化を、利用しています。
Abstract
すべて自己再生組織の恒常性は、成体幹細胞に依存しています。未分化幹細胞は非対称分裂を受けるように、彼らは幹細胞の表現型と、幹細胞のニッチから移行急速な普及を受け、末期組織を再作成するには差別トランジット増幅細胞を（TA細胞）保持の娘細胞を生成する。
上皮幹細胞は 、in vivo 1-3 の試験管内増殖能の高いとのようなスローサイクリングのラベル保持細胞との細胞として表皮、毛包、および腸内で確認されている。成人、組織特異的幹細胞は、ストレス4-5の時間帯だけでなく、正常な生理学的代謝回転の間に置かれている組織の再生のための責任があります。また、幹細胞は、一般的に組織6内の複数の細胞型を生じさせる能力を有する、複数の強力であると考えられる。例えば、げっ歯類の毛包幹細胞は表皮、皮脂腺、および毛包7-9生成することができます。私たちは、人間の毛包のバルジ領域から幹細胞が多潜在力10を示すことが示されている。
幹細胞は発生生物学、分化、腫瘍形成とそれらの可能な治療的有用性のために研究するためのin vitroの系としてのユーティリティに起因する生物医学研究における貴重なツール、となっている。それは大人の上皮幹細胞はそのような外胚葉異形成、monilethrix、ネザートン症候群、メンケス病、遺伝性表皮水疱症と脱毛11月13日のような疾患の治療に有用となる可能性があります。さらに、このようなやけどの傷、慢性創傷や潰瘍のような他の皮膚の問題は、治療14,15に関連幹細胞の恩恵を受ける。多能性の状態（iPS細胞）16,17に成体細胞の再プログラミングのための可能性を考えると、人間の皮膚に容易にアクセス可能で拡張可能な成体幹細胞が誘導とを含む病気の広い範囲のダウンストリーム治療用細胞の貴重な源を提供することがあります糖尿病とパーキンソン病。
Protocol
1。ヒト皮膚から上皮幹細胞を抽出する
- 上皮幹細胞を単離する手順を開始する前に、1つは、それぞれのメディア、試薬を（表1参照）を準備する必要があります。
- フェイスリフトの手順またはパンチ生検から新鮮な大人の人間の頭皮の皮膚が収集され、その後4℃DMEM / 10％FBS /一晩ディスパーゼ（4 mg / mL）を℃でインキュベートする37℃で2〜4時間のインキュベーションでは、° Cにも効果的です。皮膚片は、浸透する酵素を可能にするために1cmの最大幅になります。
- 滅菌シャーレに皮膚を転送する、皮膚の表面近くに毛幹を把握し、しっかりとスムーズに引っ張って皮膚からそれぞれの髪をやってのける。 、解剖顕微鏡下でその形態に基づいて、休止期の段階で卵胞を選択し（図1A）転送包は、15 mLの滅菌チューブにバルジ領域を切り取る。カットなら成長期の毛包は、毛包"膨らみ"の領域（図1B）を取得するために卵胞の上側1 / 3に使用することができます。
- 定期的に振盪しながら室温で15-20分のための0.05％トリプシン- EDTA（GIBCO）およびヴェルセン（0.53 mMのEDTA 4NA、GIBCO）（1:1）の混合物に分離された毛包の断片をインキュベート、追加、4 mLのDMEM + 10 ％FBSは、反応を停止し、800rpmで5分間スピンダウンする。また、卵胞の組織片を外植片は、単一の卵胞から培養細胞をトリプシン消化することなく文化に配置することができます。
- EGFことなく、1 mLのKCM（ケラチノサイト培地）で（セルを失うのを避けるために〜0.2から0.5 mLを保存）注意深く上清を捨て、再びサスペンド。
2。文化プライマリ上皮幹細胞
- 培養前に、上皮幹細胞は、マイトマイシンC処理した3T3 - J2細胞（フィーダー細胞）は、次のように準備する必要があります。 3T3 - J2細胞は治療前に10％FBSを含むDMEM中で培養されています。培養メディアを取り出して、PBSで2回細胞を洗浄し、37℃で2時間無血清DMEMで15μg/ mLのマイトマイシンC ° C、5％CO 2でセルを扱う。マイトマイシンC含有DMEMを除去し、PBSで2回洗い、細胞を使用できるようになります。 （マイトマイシンC処理した3T3 - J2細胞はまた、事前に準備し、一日で37インキュベート培養一次上皮幹細胞、° C、5％CO 2の前に細胞を-80℃で融解し、シードで保存。15万することができます6ウェルプレートのウェル当たり3T3 - J2細胞を推奨します。
- 37℃で一晩EGFなしKCMにおけるマイトマイシンC処理した3T3 - J2細胞上でステップ1.5からシード孤立した毛包幹細胞は、° C、5％CO 2、翌日、EGF含有KCMに変更。細胞を37で成長している· CO 2 5％を含む湿った大気中のC。すべてのケラチノサイトは、KCMは2日毎にEGFを含有する供給および14-20日のために栽培されている。顕微鏡下で毎日のセルを確認してください。毛包幹細胞は、コロニー（図2A）を形成します。毛包の外植片は、10〜14日間（図2B）の後にoutgrowthsを形成します。
3。パッセージ上皮幹細胞
- 一度PBSで細胞を洗浄する。ヴェルセン（RTに予め温めておいた）処理により3T3 - J2フィーダー細胞を取り外します。インキュベートの文化が5分間ヴェルセンにくぼんだ、その後、振とうし、フィーダー細胞をオフに吸引除去する。
- ヴェルセンまたはPBSに一度のいずれかで毛包幹細胞を洗う。
- 予め温めておいた追加（37 ° C、クリティカル）トリプシン- EDTA（2X）および37℃7分以上デタッチする毛包幹細胞のための必要に応じてのためのC。もはや15分以内が最適です。
- 、トリプシンを停止するには、KCM W / O EGFを追加軽く、200グラムでスピンダウン、細胞を分散させるために5分を上下にピペッティングし。
- マイトマイシンC処理した3T3 - J2細胞層上にEGF、カウントおよび再プレートなしKCMと再サスペンド細胞。
4。上皮幹細胞を不死化
初代細胞、さらに成体幹細胞は、培養中の連続継代し、数ヶ月後に老化に達する。主要な幹細胞の不死化には、この問題を緩和する効果的な方法です。
- 2日間のフィーダー層（3T3 - J2）と文化の道1のプレート一次上皮幹細胞（〜35万細胞/ウェル、6ウェルプレートの）。
- DMEM 10％FBSを含む、プライマリ上皮幹細胞を播種後の培養PA317 LXSN 16E6E7細胞株は、一日。 （この行は、HPV16 E6とE7のオープンリーディングフレームをコードアンフォトロピックレトロウイルスLXSN16E6E7を生成し、安定的に多くの細胞型に感染して不死化するために使用することができる）。
- 2時間マイトマイシンCとPA317 LXSN 16E6E7細胞株（3T3 - J2細胞と同じプロトコル）を扱います。マイトマイシンCは、EGFとKCMの6日間一次上皮幹細胞、共培養にPA317 LXSN 16E6E7細胞株を扱うに追加します。 2日おきEGFメディアで新鮮なKCMを更新。
- ヴェルセンと3T3 - J2とPA317 LXSN 16E6E7セルを削除します。追加マイトマイシンC処理した3T3 - J2 NHP細胞（ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン耐性、ウェルあたり200,000細胞）上皮幹細胞へ。細胞は、追加のためにG418（Gibco）を0.2 mg / mLの下で選択されていますitional 6日。 EGFメディア2日ごとに新鮮なG418を含むKCMを更新する。
存続上皮幹細胞は、幹細胞を不死化されます。 PA317 LXSN 16E6E7細胞と共培養されていない主な上皮幹細胞のウェルG418選択のためのコントロールとして設定する必要があります、このほかのすべてのセルが選択の6日後にG418によって殺されるべき。
5。代表的な結果
皮膚上皮幹細胞と不死化上皮幹細胞の早期成立には、フィーダー細胞に囲まれた小さなケラチノサイト（図2A）で構成されたタイトなコロニーを形成する。フィーダー層なしで、定義されているサプリメントと無血清培地で培養した場合、幹細胞が分散し、（それらが単一細胞や小さなクラスターとしての成長）タイトなコロニーを形成しません。不死化上皮幹細胞は、連続継代の> 12ヶ月間の安定した表現型を維持するが、一次電池よりも厳重なコロニーを形成する傾向があった。彼らはこれらの不死化細胞はがん細胞の特性を有していないことを示す、軟寒天アッセイにおける足場非依存性コロニーを形成しません。プライマリおよび不死化の両方上皮幹細胞は毛包幹細胞マーカーサイトケラチン15（図3A）を発現し、表皮、毛包や皮脂腺の系統（図3B - D）に分化することができます。
図1は、。髪の毛を羽をむしられた。ディスパーゼ処理皮膚から摘採した後、毛包には毛の長さを周囲の上皮のスリーブで髪の底部を周囲の細胞のボールを持って休止期クラブの毛（）のいずれかとして表示され、または成長期の毛（B）。成長期の膨らみが少なく明瞭である間休止期のバルジ領域は、ミクロ分析する明確な形態学的領域を形成する。成長期の電球はまた、単離され、培養することができる中継増幅のセルを表す行列のケラチノサイトを、含まれています。
図2。幹細胞の培養。 （A）細胞（Fで指定された）のフィーダー層とKCMで培養皮膚のフォームタイト上皮コロニー（Eによって指定される）から上皮幹細胞。 （B）毛包の外植片は上皮outgrowthsを生じさせる。休止期のバルジ領域は、（Tが指定する）皿に取り付けられ、フィーダー細胞とともに上皮細胞のコロニーを囲まれています。
図3：細胞分化の幹。 （A）幹細胞のコロニーは、サイトケラチン15の上皮マーカーの発現を維持する。 （B）皮膚上皮幹細胞は、K6Hf式によって決定された毛包系列に沿って分化させることができる。 （C）細胞は、空気 - 液体界面でのデ - epidermalized真皮または他のマトリックス上で培養することができ、角質層、顆粒層および有棘層で層別表皮を形成することになる。 （D）幹細胞をオイルレッド、正球と皮脂系統に沿って誘導することができる。
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Discussion
に記載の細胞抽出および培養方法は、驚くほど容易なと再現性です。我々は、継承された皮膚の欠陥18の患者を含む幅広い年齢範囲にわたって個人の数十から上皮幹細胞培養物を生成している。組織の収穫の日にプロセスを開始することをお勧めですが、細胞が必要な場合は翌日配達を促進する、数日間氷上メディアで実行可能なままになります。破棄されたフェイスリフトスキンは、単一の細胞懸濁液などの細胞抽出のための実行可能な卵胞の数百を得られます。トリプシン処理し、遠心分離で細胞の損失の少ないチャンスがあるので、そのような頭皮のパンチ生検から、より限定された組織については、外植片培養が、より効果的かもしれない。外植片の培養の場合は、最も重要な側面は、皿に組織片のアタッチメントです。 outgrowthsが10-14日に表示されるまで、単に組織と最小限の操作をカバーするメディアの少量の添加が推奨されます。
皮膚から成体上皮幹細胞は、幅広いアプリケーションを持つことができます。培養皮膚細胞は、火傷患者および慢性創傷の臨床応用に既に存在する。現在の課題は、汗腺や毛とのより良い皮膚の等価を作成するとなっています。毛髪再生のための皮膚の幹細胞の潜在的な利用は、エキサイティングな可能性があります。
前述したように、成人の細胞で原始的多能性の状態を誘導する能力は、胚性幹細胞16,17の利用なしに潜在的な細胞ベースの治療のための重要な進歩を表しています。ウイルスベクターが、幹細胞の遺伝子の発現を誘導するために使用されるしかし、プロセスは、非効率的で、潜在的に発癌性である。いずれかの成体幹細胞集団で始まる場合、それは大幅に効率を高め、安定したウイルスのトランスフェクションは、多分化能を誘導するための必要性をなくすことができる。骨髄の幹細胞の移植は、表皮水疱症などの重度の皮膚疾患を治療するために、セルベースのアプローチとして利用されている。19,20さらに、表皮水疱症におけるコラーゲン7欠陥の修正が試験管内で患者ケラチノサイトで達成されている。21皮膚生検からの上皮幹細胞の分離は、この初期の作品で展開し、自己細胞を使用して個別の細胞療法を開発するためにリソースを提供することがあります。
それは、毛包のバルジ領域は、他の成体幹細胞/前駆細胞プールのサイトであることは興味深い。 Xu ら 22は、この地域からの多能性間葉系幹細胞を特定している。メラノサイト前駆体はまた毛の膨らみ23に存在します。従って、ここで紹介する毛包の分離方法は、簡単に、さらに実験のためにこれらの他のタイプの細胞を分離するために適応させることができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIH / NCIの助成金R01CA - 118916によって資金を供給される
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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