Summary
En snabb, robust sätt att isolera livskraftiga vuxna epitelceller stamceller från mänsklig hud beskrivs. Metoden utnyttjar enzymatisk nedbrytning av hudens kollagen matrix, följt av plockning av hårsäckarna och isolering av enstaka cellsuspensioner eller fragment vävnad för cellodling.
Abstract
Den homeostas av alla själv förnya vävnader är beroende av vuxna stamceller. Som odifferentierade stamceller genomgå asymmetrisk divisioner, genererar de dottern celler som behåller fenotyp stamceller och transit-förstärkning celler (TA celler) att migrera från stamceller nisch, genomgår en snabb spridning och obotligt differentiera att återbefolka vävnaden.
Epitelceller stamceller har identifierats i epidermis, hårsäckar och tarmar som celler med hög in vitro-proliferativ potential och som långsamt cykla etiketten behålla celler in vivo 1-3. Vuxen, vävnads-specifika stamceller ansvarar för regenerering av vävnader där de bor under normala fysiologiska såväl omsättning som under tider av stress 4-5. Dessutom är stamceller i allmänhet vara flera potent, som har förmågan att ge upphov till flera celltyper i vävnaden 6. Till exempel kan gnagare hårsäcken stamceller generera överhuden, talgkörtlar och hårsäckar 7-9. Vi har visat att stamceller från mänskliga hårsäcken bula regionen uppvisar flera potentialitet 10.
Stamceller har blivit ett värdefullt verktyg inom biomedicinsk forskning, på grund av deras nytta som ett in vitro-system för att studera utvecklingsbiologi, differentiering, Tumörgenesens och för deras eventuella terapeutiska nyttan. Det är troligt att vuxna epitelceller stamceller kommer att vara användbart vid behandling av sjukdomar som ektodermal dysplasier, monilethrix, Nethertons syndrom, Menkes sjukdom, ärftlig epidermolysis bullosa och alopeci 11-13. Dessutom kommer andra hudproblem såsom brännskador, kroniska sår nytta stamcellsrelalerad terapier 14,15. Med tanke på den potential för omprogrammering av vuxna celler till en pluripotenta tillstånd (iPS-celler) 16,17, får lättillgänglig och utbyggbart vuxna stamceller i huden hos människa ger en värdefull källa av celler för induktion och nedströms terapi för en mängd sjukdomar, inklusive diabetes och Parkinsons sjukdom.
Protocol
1. Utdrag Epithelial stamceller från mänskliga Skin
- Innan du börjar proceduren att isolera epitelceller stamceller måste man förbereda respektive medier och reagenser (se tabell 1).
- Färska vuxen människa hårbotten hud från ansiktslyftning förfaranden eller stansbiopsi samlas, sedan inkubera i DMEM / 10% FBS / Dispase (4 mg / ml) över natten vid 4 ° C. Inkubation för 2-4 tim vid 37 ° C är också effektivt. Hud bitar bör en maximal bredd på 1 cm för att möjliggöra enzym att penetrera.
- Överför huden i en steriliserad petriskål, dra bort varje hårstrå från huden genom att greppa hårstrået nära huden och dra stadigt och smidigt. Välj folliklar på telogen skede baserat på deras morfologi under ett dissekera mikroskop, skär ut bula regionen (Figur 1A) överför folliklar i en steriliserad 15 ml rör. Anagen folliklar kan också användas om den klipps vid övre 1 / 3 av follikelstimulerande att få hårsäcken "bula" regionen (Figur 1B).
- Inkubera isolerade follikeln fragment i en blandning av 0,05% trypsin-EDTA (GIBCO) och Versene (0,53 mM EDTA 4NA, GIBCO) (1:01) i 15-20 minuter vid rumstemperatur med skakningar med jämna mellanrum, tillsätt 4 ml DMEM + 10 % FBS att stoppa reaktionen spinn ner i 5 min vid 800 rpm. Alternativt kan follikeln vävnad fragment explants placeras i kultur utan Trypsin smälta till kultur celler från enstaka folliklar.
- Kassera supernatanten försiktigt (spara ~ 0,2-0,5 mL att undvika att förlora celler) och återsuspendera i 1 ml KCM (keratinocyte medium), utan fonden.
2. Kultur Primär Epithelial Stamceller
- Före odling av epitelceller stamceller, mitomycin C-behandlade 3T3-J2 celler (feeder celler) bör utarbetas enligt följande. 3T3-J2 celler odlas i DMEM med 10% FBS före behandling. Ta odling medier och tvätta cell två gånger med PBS, behandla cell med 15μg / ml mitomycin C i DMEM utan serum för 2 tim vid 37 ° C, 5% CO 2. Ta bort mitomycin C-innehållande DMEM och tvätta två gånger med PBS, cellerna är redo att använda. (Mitomycin C-behandlade kan 3T3-J2 celler också vara beredd tidigare och förvaras vid -80 ° C. Tina och utsäde cellerna en dag innan odling av primära epitelceller stamceller, inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2. 150,000-200,000 3T3-J2 celler per brunn av 6-brunnar rekommenderas.
- Seed isolerade hårsäcken stamceller från steg 1,5 på mitomycin C-behandlade 3T3-J2 celler i KCM utan att fonden över natten vid 37 ° C, 5% CO 2, ändras till fonden som innehåller KCM nästa dag. Celler odlas vid 37 ° C i en fuktig atmosfär som innehåller 5% CO 2. Alla keratinocyter utfodras med KCM med fonden var 2 dagar och som odlas för 14-20 dagar. Kontrollera cell varje dag under mikroskop. Hårsäcken stamceller bildar kolonier (Figur 2A). Hårsäcken explants bildar utväxter efter 10-14 dagar (Figur 2B).
3. Passage Epithelial Stamceller
- Tvätta cellerna med PBS gång. Ta bort 3T3-J2 feeder celler genom Versene (förvärmas till RT) behandling. Inkubera kultur kupade i Versene i 5 minuter, sedan försiktigt skaka och aspirera av feeder celler.
- Tvätta håret celler follikelstimulerande stamceller med antingen Versene eller PBS en gång.
- Lägg förvärmda (till 37 ° C, kritiskt) trypsin-EDTA (2X) och inkubera vid 37 ° C i 7 minuter eller längre om det behövs för hårsäcken stamceller för att lossa. Inte längre än 15 minuter är bäst.
- Lägg KCM w / o EGF att stoppa trypsin, försiktigt pipettera upp och ner för att skingra celler, spinn ner på 200g, 5 minuter.
- Återsuspendera celler med KCM utan fonden, greve och re-platta på mitomycin C-behandlade 3T3-J2 celler lager.
4. Föreviga Epithelial Stamceller
Galvaniska element, även vuxna stamceller, når åldrande efter serial passage och månader i kulturen. Immortalisering av primär stamceller är ett effektivt sätt att lindra detta problem.
- Tavla primära epitelceller stamceller (~ 350.000 celler / brunn av 6 brunnar) vid passage 1 på feeder layer (3T3-J2) och kultur för 2 dagar.
- Kultur PA317 LXSN 16E6E7 cellinje en dag efter sådd den primära epitelceller stamceller med DMEM innehåller 10% FBS. (Denna linje ger amphotropic retrovirus LXSN16E6E7 som kodar HPV16 E6 och E7 öppen läsning ramar och som kan användas för att stabilt infektera och föreviga många celltyper).
- Behandla PA317 LXSN 16E6E7 cellinje med mitomycin C under 2 timmar (samma protokoll med 3T3-J2 celler). Lägg mitomycin C behandlas PA317 LXSN 16E6E7 cellinje till den primära epiteliala stamceller, co-kultur för 6 dagar i KCM med fonden. Förnya färska KCM med EGF media varje 2 dagar.
- Ta bort 3T3-J2 och PA317 LXSN 16E6E7 cell med Versene. Lägg mitomycin-C behandlas 3T3-J2 NHP celler (neomycin, hygromycin, puromycin resistenta, ~ 200 tusen celler per brunn) till epithelial stamceller. Celler är markerade under 0,2 mg / ml G418 (Gibco) efter tilläggitional 6 dagar. Förnya färska G418 innehåller KCM med EGF media varje 2 dagar.
Överlevande epitelceller stamceller kommer att förevigad stamceller. En väl av primär epitelceller stamceller som inte är co-odlade med PA317 LXSN 16E6E7 cellen bör fastställas som en kontroll för G418 val bör alla celler i detta väl bli dödad av G418 efter 6 dagar av urval.
5. Representativa resultat
Tidig passage av hudens epitelceller stamceller och förevigade epitelceller stamceller bildar täta kolonier som består av små keratinocyter (Figur 2A) omgiven av feeder celler. Om odlade i serum fria medier med definierade kosttillskott, utan en feeder lager kommer stamceller skingras och inte bildar täta kolonier (de växer som enskilda celler och små kluster). Förevigat epitelceller stamceller upprätthålla en stabil fenotyp för> 12 månaders kontinuerlig passage, men tenderade att bilda tätare kolonier än den primära celler. De utgör inte en förankring oberoende kolonier i mjuk agar analyser tyder på att dessa förevigat celler inte har karaktär av cancerceller. Både primär-och förevigade epitelceller stamceller uttrycka hårsäcken stamceller markör Cytokeratin 15 (Figur 3A), och har möjlighet att differentieras till epidermal, hårsäcken och härstamningar sebaceous (Figur 3B-D).
Figur 1. Plockade hårstrån. Efter plockning från dispase behandlade huden, hårsäckarna visas som antingen telogen klubb hår (A) med en boll av celler som omger botten av hår, eller anagen hårstrån (B) med en hylsa av epitel kring längden på håret. Den telogen bula regionen bildar en tydlig morfologisk region till mikro-dissekera, medan anagen bula är mindre distinkt. Den anagen glödlampa innehåller matris keratinocyter, som representerar transit-förstärkning celler som också kan isoleras och odlas.
Figur 2. Stamceller kulturer. (A) Epithelial stamceller från stram hud bildar epitelceller kolonier (utsedd av E) vid odling i KCM med en feeder lager av celler (som utses av F). (B) hårsäcken explants ge upphov till epiteliala utväxter. Den telogen utbuktning regionen (utsedda av T) är knuten till skålen och omgiven epitelceller koloni tillsammans med feeder celler.
Figur 3. Stamceller differentiering. (A) Stamceller kolonier upprätthålla uttryck för epiteliala markörer som Cytokeratin 15. (B) Hud epitelceller stamceller kan differentieras längs hårsäcken härstamning som bestäms av K6Hf uttryck. (C) Cellerna kan odlas på de-epidermalized dermis eller andra matriser på luft-vätska gränssnitt och kommer att utgöra en skiktad epidermis med cornified lager, korniga lager och ryggkotornas lager. (D) Stamceller kan induceras längs sebaceous härstamning med olja Red positiva fettkulor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellen utvinning och kultur beskrivna metoderna är förvånansvärt lättvindigt och reproducerbara. Vi har genererat epitelceller kulturer stamceller från dussintals av individer inom ett brett åldersintervall, inklusive patienter med ärftlig skalet 18. Det är bäst att starta processen på dagen för vävnaden skörd, men cellerna förblir livskraftiga i media på is i flera dagar, underlätta natten frakt om det behövs. Kasserade ansiktslyftning hud skördar hundratals livskraftiga äggblåsor för cell utvinning som enda cellsuspensioner. För mer begränsad vävnad, till exempel från en punch biopsi i hårbotten, kan Explantation kulturer vara mer effektiva, eftersom det är mindre chans för cell förlust i trypsinization och centrifugering. För Explantation kulturer, är den viktigaste aspekten fastsättning av vävnad fragment till skålen. Tillsats av små mängder av media precis täcka vävnaden och minimal manipulation rekommenderas tills utväxter visas i 10-14 dagar.
Vuxna epitelceller stamceller från huden kan ha en bred tillämpning. Odlade hudceller redan är i klinisk tillämpning för att bränna patienter och kroniska sår. Utmaningen nu har blivit en bättre hy motsvarande med svettkörtlarna och hår. Den potentiella användningen av hudens stamceller för hår förnyelse är spännande möjlighet.
Som tidigare nämnts innebär förmågan att framkalla ett primitivt pluripotenta stat i vuxna celler ett betydande framsteg för potentiella cellbaserade terapier utan användning av embryonala stamceller 16,17. Däremot är processen ineffektiv och potentiellt onkogena, eftersom virala vektorer används för att inducera uttryck av gener stamceller. Om man börjar med en adulta stamceller befolkningen, kan det öka kraftigt effektiviteten och undanröja behovet av stabila virus transfections att inducera pluripotens. Transplantation av stamceller benmärgsceller har använts som en cell-metod för att behandla allvarliga hudsjukdomar som epidermolysis bullosa. 19,20 Dessutom har korrigering av kollagen 7 fel i epidermolysis bullosa uppnåtts i patientens keratinocyter in vitro. 21 Isolering av epitelceller stamceller från en hudbiopsi kan ge resurser för att expandera på detta tidigare arbete och att utveckla individualiserade cellterapi med hjälp av autologa celler.
Det är intressant att hårsäcken bula regionen är också platsen för andra celler / progenitorceller adulta stamceller pooler. Xu et al. 22 har identifierat multipotenta mesenkymala stamceller från denna region. Melanocyte prekursorer bor också i håret bula 23. Således kan hårsäcken isolering metod som presenteras här enkelt anpassas för att isolera dessa andra celltyper för vidare experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av NIH / NCI bevilja R01CA-118.916
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
References
- Jones, P. H., Watt, F. M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73, 713-724 (1993).
- Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).
- Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm. Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).
- Slac, J. M.
- It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11, 1351-134 (2005).
- Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell. 102, 451-461 (2000).
- Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell. 104, 233-245 (2001).
- Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In vitro Cell. & Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).
- Ohyama, M., Vogel, J. C. G. ene
- Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system. Gene Ther. 13, 732-737 (2006).
- Stenn, K. S., Cotsarelis, G. Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology. Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).
- Hoeller, D. An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10. , 264-271 (2001).
- Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra). Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).
- Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH. Science. 314, 982-985 (2006).
- Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells. Blood. 113, 1167-1174 (2009).
- Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).
- Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa. J Invest Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science. 307, 720-724 (2005).
