Summary
Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.
Abstract
Kendini sürekli yenileyen dokuların homeostazı yetişkin kök hücreleri üzerinde bağlıdır. Farklılaşmamış kök hücreleri asimetrik bölünmeler tabi olarak, onlar, kök hücre fenotipi ve kök hücre niş göç, hızlı bir şekilde çoğalması geçmesi ve ölümcül doku yeniden doldurmanız ayırt etmek için transit yükseltme hücreleri (TA hücreleri) korumak kızı hücreler üretir.
Epidermis, saç folikülü ve bağırsak epitel kök hücreleri, in vitro proliferatif potansiyeli yüksek ve yavaş bisiklet hücreleri in vivo 1-3 etiket istinat hücreler olarak tespit edilmiştir. Yetişkin, doku spesifik kök hücrelerin, normal fizyolojik ciro sırasında yanı sıra stres 4-5 zamanlarda yaşadığınız dokuların rejenerasyonu için sorumludur . Ayrıca, kök hücreler genellikle 6 doku içinde birden fazla hücre tiplerinin ortaya çıkmasına neden kapasitesine sahip, çok güçlü olması için kabul edilir. Örneğin, kemirgen saç folikülü kök hücreler, epidermis, yağ bezleri, ve saç foliküllerinin 7-9 üretebilir . Biz insan saç folikülü çıkıntı bölge kök hücrelerinin çok-potansiyellik 10 sergilediklerini göstermiştir.
Kök hücreler, biyomedikal araştırma, gelişim biyolojisi, farklılaşma, tümörogenez ve onların olası tedavi yarar için eğitim in vitro sistemi olarak yarar nedeniyle değerli bir araç haline gelmiştir. Bu, yetişkin epitel kök hücreleri ektodermal displazileri, monilethrix, Netherton sendromu, Menkes hastalığı, kalıtsal epidermolizis bülloza ve alopesilerde 11-13 gibi hastalıkların tedavisinde yararlı olacağı muhtemeldir . Ayrıca, yanık yaraları, kronik yaralar ve ülser gibi diğer cilt problemleri, terapiler 14,15 ile ilgili kök hücre fayda sağlayacaktır . Pluripotent devlet (iPS hücreleri) 16,17 yetişkin hücreleri yeniden programlama için potansiyel göz önüne alındığında, insan derisi kolaylıkla erişilebilir ve genişletilebilir bir yetişkin kök hücre hastalığı da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede hücrelerinin indüksiyonu ve alt tedavisi için değerli bir kaynak sağlayabilir diyabet ve Parkinson hastalığı.
Protocol
1. İnsan Cilt Epitel Kök Hücreler Özü
- Epitel kök hücreleri izole işlemine başlamadan önce ilgili medias ve reaktifler (tablo1) hazırlamak gerekiyor.
- Yüz germe işlemleri veya punch biyopsi taze yetişkin insan saçlı deride toplanır, daha sonra DMEM 4 /% 10 FBS / gecede Dispase (4 mg / ml) ° C de inkübe 2-4 saat süreyle inkübasyon 37 ° C de etkilidir. Cilt adet nüfuz enzim için izin maksimum genişliği 1 cm olmalıdır.
- Steril bir Petri kabı içine Transfer cilt, cilt, cilt yüzeyine yakın saç gövdesine açgözlü ve sağlam bir şekilde ve sorunsuz çekerek her saç çekin. Diseksiyon mikroskobu altında kendi morfolojisine göre telojen aşamada follikül seçin, transfer folikülleri (Şekil 1A), 15 ml steril tüpe şişkinliği bölge kesip. Anajen folikülleri 1 / 3 üst folikül kesme, saç folikülü "çıkıntı" bölge (Şekil 1B) elde etmek için de kullanılabilir.
- % 0.05 tripsin-EDTA (Gibco) ve Versene (0.53 mM EDTA 4NA, Gibco) (1:1) karışımı oda sıcaklığında 15-20 dakika süreyle periyodik sallayarak izole folikül parçaları inkübe ekleyebilir, 4 ml DMEM + 10 % FBS 800 rpm'de 5 dakika süreyle durdurmak tepki aşağı spin. Alternatif olarak, folikül doku parçası eksplantlar tek foliküller kültür hücreleri kültür tripsin sindirmek olmadan yerleştirilmiş olabilir.
- Dikkatle supernatant atın (hücreleri kaybetmemek için kaydetmek ~ 0.2-0.5 ml) ve 1 ml EGF olmadan KCM (keratinosit orta), yeniden askıya.
2. Kültür İlköğretim Epitel Kök Hücreler
- Önce epitel kök hücreler kültür-J2-3T3 hücreleri (besleyici hücreler) aşağıdaki gibi hazırlanmalıdır C-tedavi mitomisin. J2-3T3 hücreleri tedavi öncesi 10% FBS ile DMEM kültür. Kültür ortamı çıkarın ve hücre PBS ile iki kez yıkamak 37 2 saat süreyle serum olmadan DMEM 15μg / ml mitomisin C ° C,% 5 CO 2 hücre tedavisi . Mitomisin C içeren DMEM çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın, hücreler kullanıma hazır. (Mitomisin C-tedavi-J2-3T3 hücreleri de -80 önceden hazırlanmış ve saklanabilir ° C. çözülme ve tohum hücreleri kültür primer epitelyal kök hücreler bir gün önce, 37 inkübe ° C,% 5 CO 2. 150.000-200.000 de ortalama 6-plaka-J2-3T3 hücreleri tavsiye edilir.
- Mitomisin adım 1.5 Tohum izole saç folikülü kök hücre geceleme EGF 37 olmadan KCM 3T3-J2-hücreleri C-tedavi ertesi gün EGF içeren KCM değiştirildi ° C,% 5 CO 2. Hücreler 37 yetiştirilir ° C% 5 CO 2 içeren bir nemli bir atmosfer . Tüm keratinositler KCM içeren EGF ile beslenen her 2 günde bir ve 14-20 gün için yetiştirilmektedir. Mikroskop altında hücre her gün kontrol edin. Saç folikülü kök hücrelerin koloniler (Şekil 2A) oluşturacaktır. Saç folikülü eksplantlar 10-14 gün sonra (Şekil 2B) çıkıntılar oluşturacak.
3. Passage Epitel Kök Hücreler
- Hücreler PBS ile bir kez yıkayın. Versene (RT önceden ısıtılmış) tedavisi ile 3T3-J2-besleyici hücreler çıkarın. 5 dakika inkübe kültür Versene de bombeli, sonra yavaşça sallamak ve besleyici hücreler aspire.
- Versene veya PBS bir kez ya da kıl folikülü kök hücreler yıkayın.
- Önceden ısıtılmış ekle (37 ° C, kritik) tripsin-EDTA (2X) ve 37 inkübe ° C 7 dakika veya daha uzun bir süre ayırmak için saç folikülü kök hücre için gerekli. Artık az 15 dakika en iyisidir.
- Tripsin durdurmak için KCM w / o EGF ekle yavaşça 200g aşağı dönmeye hücreleri dağıtmak için 5 dakika aşağı yukarı pipet ve.
- Mitomisin C-tedavi 3T3-J2-hücre tabakası EGF, Say ve yeniden plaka olmadan KCM hücreleri yeniden askıya.
4. Epitel Kök Hücreler ölümsüzleştirin
İlköğretim hücreleri, hatta erişkin kök hücreler, seri geçit ve kültür ay sonra yaşlanması ulaşır. Birincil kök hücrelerin ölümsüzleşme Bu sorunu gidermek için etkili bir yoldur.
- Plate 2 gün boyunca birincil epitel kök hücreleri besleyici tabaka geçit 1 (~ 350.000 hücre / 6 plaka) (3T3-J2) ve kültür.
- Kültür PA317 LXSN 16E6E7 hücre hattı DMEM% 10 FBS içeren primer epitelyal kök hücrelerin ekim sonra bir gün. (Bu çizgi HPV16 E6 ve E7 açık okuma çerçeveleri kodlar amphotropic retrovirüs LXSN16E6E7 üretir ve stabil bir şekilde bulaşabilen ve birçok hücre tipleri ölümsüzleştirmek için kullanılabilir).
- PA317 LXSN 16E6E7 hücre hattı 2 saat boyunca mitomisin C (J2-3T3 hücreleri ile aynı protokolü) ile ödüllendirin. Mitomisin C EGF ile KCM 6 gün PA317 LXSN 16E6E7 hücre birincil epitel kök hücreler hattı, ko-kültür tedavi ekleyin. Her 2 günde bir, taze KCM EGF medya yenileyin.
- 3T3-J2 çıkarın ve PA317 LXSN 16E6E7 Versene hücre. Mitomisin-C tedavi 3T3-J2-NHP hücreleri (neomisin, hygromycin, puromycin dayanıklı, iyi başına ~ 200.000 hücre) epitel kök hücreler. Hücreler eklemek için G418 (Gibco) 0.2 mg / ml altında seçilir6 gün itional. EGF medya her 2 günde bir taze G418 içeren KCM yenileyin.
Surviving epitel kök hücreler, kök hücreler ölümsüzleştirdi. G418 seçimi için bir kontrol olarak PA317 LXSN 16E6E7 hücre ile birlikte kültür değildir primer epitelyal kök hücrelerin iyi ayarlanması gerekir, bu iyi seçim 6 gün sonra tüm hücreleri G418 tarafından öldürülmüş olmalıdır.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Deri epitel kök hücre ve epitel kök hücreleri ölümsüzleştirdi erken geçiş, besleyici hücreler ile çevrili küçük keratinositler (Şekil 2A) oluşan sıkı koloniler oluşturur. Besleyici bir tabaka olmadan, tanımlanan takviyeleri ile serum serbest medya kültürü, kök hücreler sıkı koloniler (bunlar tek hücreleri ve küçük kümeler gibi büyümeye) dağıtmak ve formu değil. Ölümsüzleştirilmiştir epitel kök hücreler sürekli geçiş> 12 ay boyunca istikrarlı bir fenotip korumak, ancak birincil hücreler daha sıkı koloniler oluşturmaya eğilimli. Onlar, yumuşak agar tayinlerde bu ölümsüzleştirdi hücrelerin kanserli hücrelerin özelliklere sahip olmadığını belirten ankraj bağımsız koloniler oluşturmak yok. Birincil ve epitel kök hücreleri ölümsüzleştirdi Hem saç folikülü kök hücre belirteci sitokeratin 15 (Şekil 3A) ifade ve epidermal, saç folikülü ve sebase soyları (Şekil 3B-D) ayırt etmek mümkün.
Şekil 1. kıllar çekti. Toplandıktan sonra dispase ile tedavi edilen cilt, saç folikülleri telojen (B) bir kol ile saç uzunluğu çevreleyen epitel hücrelerinin saç alt çevreleyen bir top ile kulüp kıllar (A) ya da anagen saçlar ya görünür. Telogen çıkıntı bölge anajen çıkıntı daha belirgin iken, mikro-incelemek için ayrı bir morfolojik bölge oluşturur. Anagen ampul de izole ve kültür olabilir transit yükseltme hücreleri temsil eden matris keratinositler içerir.
Şekil 2. Kök hücre kültürleri. (A), cilt hücreleri (F tarafından belirlenmiş) besleyici bir tabaka ile KCM kültür formu sıkı epitel koloniler (E tarafından belirlenmiş) epitelyal kök hücreleri. (B) Saç folikülü eksplantlar epitelyal çıkıntılar doğuran. Telogen çıkıntı bölge (T tarafından belirlenen) çanak bağlı ve besleyici hücreler birlikte epitel hücre kolonisi çevrilidir.
Şekil 3. Kök hücre farklılaşması. (A) Kök hücreler koloniler sitokeratin 15 gibi epitel belirteçleri ifade korumak. (B) Cilt epitel kök hücreler, K6Hf ifade tarafından belirlenen saç folikülü soy boyunca ayırt edilebiliyor. (C), hava-sıvı arayüzü de-epidermalized dermis veya diğer matrisler hücreler kültür ve açığa çıkan tabaka, granüler tabaka ve spinöz tabakası ile tabakalı epidermis oluşturacak. (D) Kök hücreler Oil Red olumlu globülleri yağ soy boyunca teşvik edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan hücre çıkarma ve kültür yöntemleri, şaşırtıcı derecede uyduruk ve tekrarlanabilir. Biz, kalıtsal bir cilt kusurları 18 olan hastalar da dahil olmak üzere geniş bir yaş yelpazesinde bireylerin onlarca, epitel kök hücre kültürleri var. Doku hasat gününde işlemine başlamak için en iyisidir, ancak hücreleri gecede nakliye kolaylaştırmak gerekirse, birkaç gün boyunca buz üzerinde medyada canlı kalacaktır. Atılan facelift cilt, tek bir hücre süspansiyonları olarak hücre çıkarılması için uygulanabilir köklerinin yüzlerce verir. Kafa derisinin bir punch biyopsi gibi daha sınırlı doku için trypsinization ve santrifüj hücre kaybı daha az şansı olmadığından, eksplant kültürleri daha etkili olabilir. Eksplant kültürler için, en önemli yönü, çanak doku parçası ektir. 10-14 gün çıkıntılar ortaya çıkıncaya kadar sadece doku ve minimal manipülasyon kapsayan medya küçük miktarda eklenmesi tavsiye edilir.
Deri epitel Yetişkin kök hücreleri geniş bir uygulama olabilir. Kültüre cilt hücrelerini yanık hastaları ve kronik yaralar için klinik uygulama zaten. Şimdi sorun, ter bezleri ve kıl ile daha iyi bir deri eşdeğerinde haline gelmiştir. Saç rejenerasyonu için deri kök hücrelerin potansiyel kullanım heyecan verici bir olasılık.
Daha önce de belirttiğimiz gibi, ilkel bir yetişkin hücrelerin pluripotent devleti ikna etmek için yetenek, embriyonik kök hücrelerin 16,17 kullanımı olmadan potansiyel hücre temelli tedaviler için önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir. Viral vektörlerin, kök hücre genlerin ifade ikna etmek için kullanılan Ancak, bu süreç, verimsiz ve potansiyel onkojenik. Bir yetişkin kök hücre popülasyonu ile başlarsa, büyük ölçüde etkinliğinin artırılması ve istikrarlı viral transfections pluripotency ikna etmek için gerek bırakmayacak. Epidermolysis bullosa gibi ciddi cilt hastalıklarının tedavisinde kemik iliği kök hücre transplantasyonu, hücre tabanlı bir yaklaşım olarak kullanılmıştır. 19,20 Ayrıca, in vitro hasta keratinositler epidermolysis bullosa kolajen 7 kusurun düzeltilmesi sağlanmıştır . 21 bir cilt biyopsisi epitel kök hücrelerin izolasyonu, bu daha önceki çalışmaları üzerine, otolog hücrelerin kullanarak bireyselleştirilmiş hücre tedavileri genişletmek ve geliştirmek için kaynak sağlayabilir.
Bu saç folikülü çıkıntı bölge aynı zamanda diğer yetişkin kök hücre / progenitör hücre havuzu site ilginç. Xu ve ark. 22 multipotent mezenkimal kök hücreleri bu bölgeden tespit etmiştir. Melanosit öncüleri de 23 saç çıkıntı bulunur. Bu nedenle, burada sunulan saç folikülü izolasyon yöntemi daha fazla deney için bu diğer hücre türleri izole etmek için kolayca adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü / NCI hibe R01CA-118.916 tarafından finanse edilmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
References
- Jones, P. H., Watt, F. M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73, 713-724 (1993).
- Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).
- Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm. Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).
- Slac, J. M.
- It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11, 1351-134 (2005).
- Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell. 102, 451-461 (2000).
- Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell. 104, 233-245 (2001).
- Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In vitro Cell. & Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).
- Ohyama, M., Vogel, J. C. G. ene
- Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system. Gene Ther. 13, 732-737 (2006).
- Stenn, K. S., Cotsarelis, G. Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology. Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).
- Hoeller, D. An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10. , 264-271 (2001).
- Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra). Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).
- Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH. Science. 314, 982-985 (2006).
- Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells. Blood. 113, 1167-1174 (2009).
- Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).
- Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa. J Invest Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science. 307, 720-724 (2005).
