Dissekering av en mus Eye för en hel berget av pigmentepitelet

Summary

En formell demonstration av dissekering av en mus öga, vilket resulterar i en hel montera av pigmentepitelet.

Abstract

Den pigmentepitelet (RPE) ligger på baksidan av däggdjur ögat, precis under neurala näthinnan, som innehåller fotoreceptorer (stavar och tappar). RPE är ett monolager av pigmenterade cuboidal celler och medarbetare i nära samarbete med neurala näthinnan precis ovanför det. Denna förening gör RPE av stort intresse för forskare som studerar retinala sjukdomar. RPE är också platsen för en in vivo-test av homologi riktad DNA-reparation, p ^un-analysen. Musen ögat är särskilt svår att dissekera på grund av sin ringa storlek (ca 3,5 mm i diameter) och dess sfäriska form. Denna artikel visar i detalj ett förfarande för dissektion av ögat vilket resulterar i ett helt berg RPE. Vid detta förfarande visar vi hur du arbetar med, snarare än mot, den sfäriska struktur i ögat. Kortfattat, är bindväv, muskler och synnerven bort från baksidan av ögat. Då är hornhinnan och linsen tas bort. Därefter är strategiska nedskärningar som leder till betydande utplaning av de återstående vävnad. Slutligen är neurala näthinnan försiktigt lyftas av, avslöjar en intakt RPE, som fortfarande är knuten till den underliggande åderhinnan och sklera. Hela fäste kan användas för att utföra p ^un-analysen eller för immunohistokemi eller immunofluorescens bedömning av RPE vävnad.

Protocol

1. Ta bort Främmande vävnad från utsidan av ögat

1. Häll 1X PBS i locket för en 35mm maträtt. Nivån bör vara strax under kanten av locket.
2. Använda rak pincett, överföring ögat (s) från lagring röret till 35 mm skålen. Ögonen är nedsänkt i PBS av två skäl: 1. Den främmande vävnad kommer att "flyta" bort från ögat så att du kan se och ta bort dem lätt, och 2. Under dissektion kommer ögat har naturligt sin sfäriska form, medan i suspension, så att du kan arbeta med denna form i stället för mot den.
3. Använd båda par vinklade peang (45 ° och 15 °), försiktigt bort så mycket muskler och bindväv som möjligt, att dra i vävnaden mot strömmen (dvs. mot hornhinnan). Vissa bindväv kommer att finnas kvar. Ansträngningar bör göras för att klämma ögongloben så lite som möjligt.
4. Handel dina 15 ° pincett för våren saxar. Håll ögonen stadigt med 45 ° pincett, använd våren sax för att klippa bort resterande muskler och bindväv, liksom synnerven. * Tips: Använd yttre kanten av sax för att driva vävnaden mot strömmen (mot corneo-skleral klyftan) och sedan trim. Fortsätt tills alla främmande vävnad har tagits bort från ögat.

2. Ta bort hornhinnan och linsen

1. Med hornhinnan uppåt, använd 45 ° pincett för att nypa upp en liten vik i mitten av hornhinnan.
2. Använda våren sax, gör ett litet snitt vid basen av luckan. Släpp fliken.
3. Håll ögonen fortfarande med din tång, sätt den nedre sax bladet i och vinkelrätt mot snittet och göra ett snitt mot corneo-skleral klyftan. Försök att hålla din nedre kniven i iris så både hornhinnan och iris kapas. Klipp inte hela vägen till corneo-skleral klyftan. Håll sax in i ögat.
4. Använda 45 ° pincett försiktigt rotera ögat så att saxen är parallella med corneo-skleral dela sig och göra ett litet snitt. Sakta vrider ögat 360 °, vilket gör små snitt hela vägen runt. Återigen, försök att hålla den nedre bladet på din våren sax under iris så både iris och hornhinnan skärs. Lyft iris och hornhinnan bort från resten av ögat och kasta dem.
5. Luta öga på sin sida och tryck försiktigt ner på den bakre delen av ögat, tvingar objektivet ut. Kasta linsen. Insidan av återstående ögonmusslan är kantad av neurala näthinnan, som ska se slät och ogenomskinlig.

3. Kvartal den resulterande ögonmusslan, vilket resulterar i en 4 - "petaled", blomma-liknande struktur

1. Ögat bör placeras så att öppningen av ögonmusslan är vinkelrät mot kroppen. Använd din 45 ° pincett för att stabilisera och positionera ögonmusslan.
2. Håll din våren sax framför dig så de är vinkelräta mot din kropp, sätt den nedre bladet på din våren saxen i den övre kanten av det öppna ögat koppen. Använda 45 ° pincett försiktigt anpassa ögat koppen så att en enda rakt snitt kan göras från corneo-skleral dela mot papillen. Alla styckningsdelar skall vara vinkelrätt mot corneo-skleral söndra och om inte annat anges, bör gå så nära papillen som möjligt utan att skära i den.
3. Vrid ögonmusslan 180 °, behåller sin vinkelräta med din kropp. Använd tekniken i steg 3,2 att göra en andra vinkelrätt snitt.
4. Vrid ögonmusslan och upprepa den teknik som beskrivs i 3,2 för att göra två snitt. Alla fyra nedskärningar bör vara så nära 90 ° ifrån varandra som möjligt. Tänk på att ögat inte är helt sfärisk, så det blir några variabilitet.

4. Skär varje av de fyra "blomblad" i halv, vilket resulterade i en åtta kronblad blomma-liknande struktur

1. Överför inkvarterade ögonmusslan från 35mm skålen till en ren bild. Med ögonmusslan uppåt, skopa i det med 45 ° pincett. Lyft försiktigt ut den ur vätskan och placera den på en ren bild.
2. Använd båda par vinklade pincett, öppna försiktigt ut ögat med neurala näthinnan uppåt. TA INTE neurala RETINA-det hjälper ögat att upprätthålla några av dess sfäriska form så att du inte arbetar mot den. Det skyddar också RPE från att oavsiktligt skadas i följande procedurer.
3. Rotera bilden tills en av kronbladen är vinkelrät mot kroppen.
4. Använd din 15 ° pincett försiktigt tag i hörnet av kronblad. I hörnet av bladet bör hornhinna, inte neurala näthinnan eller RPE. Lyft på hörnet försiktigt, så att den kan behålla sin krökning.
5. Sätt ner bladet på din våren saxen mellan bladet och bild. Rada upp dina saxar så att en enda rak, vinkelräta snitt kan göras från corneo-skleral dela mot papillen. Skär så nära papillen som möjligt utan att skära i den. Släppbladet, så att den ligger på bilden.
6. Rotera bilden 90 °, så att nästa kronblad är vinkelrät mot kroppen. Upprepa steg 4,5.
7. Upprepa steg 4,5 och 4,6 gånger mer. Den resulterande strukturen ska se ut som en åtta kronblad blomma.

5. Ta bort neurala näthinnan

1. Pipettera 100-200 mikroliter 1X PBS mot provexemplaret. Detta förhindrar att neurala näthinnan fastnar när man skalar bort det av RPE.
2. Typiskt neurala näthinnan är löst knuten till RPE. Däremot tar det praxis och skicklighet för att ta bort bara de neurala näthinnan och inte RPE. Ta försiktigt tag i ett blomblad i neurala näthinnan med ett par vinklade tång samtidigt stabilisera (hålla ner) resten av ögat med den andra par vinklade tång. Dra neurala näthinnan borta från resten av ögat. Upprepa tills hela neurala näthinnan har tagits bort. * Tips: pinne toppen av din 15 ° pincetten i papillen att förankra ögat. Använd sedan 45 ° pincett för att sopa upp under neurala näthinnan och lyft av den och bort. Det är oftast bäst att lyfta neurala näthinnan från synnerven huvudet mot corneo-skleral klyftan. Var noga med att dra bort alla lösa rester av iris. Iris är ganska kladdig och kan annars fastna på RPE.
3. Skölj provet med 1X PBS. Pipettera 100-200 mikroliter 1X PBS i provet och suga upp den igen. Kassera PBS. Upprepa vid behov för att ta bort damm och smuts.

6. Montera du prov (s) på en bild

1. Pipettera 80-90 mikroliter av 90% glycerol på en ny bild i en rektangulär form. Använd sidan av pipettspetsen för att göra en jämn, rektangulära utstryk av glycerol. (Detta är det förfarande för montering av två RPE på en bild.)
2. Sätt i underarmen på 15 ° tång under provet. Lyft försiktigt provet från dissekera bilden.
3. Sakta lägre provet i glycerol. Försiktigt vicka tången när du drar dem ut från under provet.
4. Upprepa steg 6,1-6,3 för de andra provet.
5. Rotera bilden så att den långa sidan är vinkelrät mot kroppen. Håll skyddsglas i 45 ° vinkel i bilden så att den vidrör bilden. Flytta den mot glycerol smeta tills de touch. Att upprätthålla kontakt mellan skyddsglas och skjut långsamt flytta täckglaset från cellprov, mot kanten av bilden. Rada upp de långa sidorna av bilden och täcker glaset så att de är parallella. Håll hörn av omslaget glaset mellan tummen och pekfingret.
6. Plocka upp 15 ° pincetten i den andra handen. Cradle den övre (gratis) kanten av glaset i skurk i armen. Mycket långsamt, sänk skyddsglas. När kontakt görs mellan täckglaset och glycerol, stanna och vänta på glycerol att migrera. Upprepa denna sänkning och väntar tills RPE hela fästen är helt täckta. Detta för att förhindra den mycket trögflytande glycerol från att fånga luftbubblor. INTE Tryck ner COVERGLASS - glycerolen kommer att pressa ut från under den, vilket gör vidhäftning mycket dålig.
7. Med tydliga nagellack, måla runt kanterna där täckglaset och skjut möts.
8. Placera bilden på toppen av ett tomt rack för att torka.

7. Representativa resultat:

Resultatet av detta förfarande bör en struktur som ser ut som en blomma och bör vara ganska symmetrisk.

Figur 1. Hela montera RPE från en wildtype C67Bl/6J mus. RPE från svart eller agouti djur bör mörkbruna och bör ha en slät yta. Det är normalt att märka vågrörelser i topografi kronbladen. Den pigmentering på någon ger prov kan vara något varierande, beroende på varierande täthet av pigmentering av både RPE och den underliggande åderhinnan. Vita pilarna pekar på hypopigmenterade "kanaler" - detta är normalt och beror på den underliggande kärlen i ögat. Blå pil pekar på fysiska skador på både RPE och den underliggande åderhinnan.

Figur 2. Hela montera RPE från en utspädd mus. Prover skördas från späda djur kan variera i färg från nästan genomskinligt till café au lait och något exemplar är att ha variation inom det, som anges i svarta cirklar här. I allmänhet RPE skördas från yngre djur är lättare och de som skördas från äldre djur är mörkare. Svart pilarna visar några av de underliggande kärlsystemet, som visas hypopigmenterade.

Figur 3. Phalloidin färgning kan användas för att upptäcka fysiska skador på RPE. Phalloidin färgning beskriver tydligt cellenmembran, som visar sexkantiga formen på epitelet. (A) Exempel från en svart mus. (B) Exempel från en utspädd mus.

Figur 4. En dåligt dissekerat RPE från en utspädd mus. (A) Hakparenteser indikerar marginaler hornhinna som är för bred, vilket kan orsaka instabilitet och / eller fällbara. Inom den svarta cirkeln kan man se stora mängder främmande vävnad som inte har avlägsnats från baksidan av ögat. De är särskilt tydligt eftersom provet är från en utspädd djur. Bladet längst ner till vänster är delvis viks över. (B) Hela fäste ser ut som en vindsnurra. Svart pilarna visar några av de nedskärningar som gjorts. Många av de styckningsdelar från corneo-skleral dela mot papillen är inte i linje med den diameter. (C) Svarta pilar visar hur nedskärningarna skulle ha gjorts, i linje med diameter och vinkelrätt mot tangenten.

Discussion

RPE är platsen för p ^FN-analysen, en in vivo-test av homologi riktad reparation. P ^un-analysen har använts för att studera effekterna av olika DNA-skador ^1,2 och DNA-skador signalsystem och gener reparation ^3,4,5 på frekvensen av homologi riktad reparation. Denna analys är mycket känslig, upptäcka encelliga händelser på RPE ^1. Det kan också upptäcka skillnader i tidpunkten för homologi riktad reparation händelser under utveckling ^6. Den murina ögat utvecklas radiellt utåt från synnerven ⁷ och därför korrelerar den relativa avståndet händelser från papillen till den tid i utvecklingen där de inträffade.

RPE är även av intresse för dem som studerar näthinnan utveckling eller retinala sjukdomar. Även RPE celler kan odlas, det finns stora begränsningar att göra det. Vuxna RPE celler efter mitotiska ⁷ och förutsägbart inte föröka väl in vitro. Dessutom, de kulturer som växer visar många förändringar, inklusive men inte begränsat till förändringar i pigmentering, morfologi, och korsningar cell ⁸ - några av de egenskaper som står i fokus för vetenskaplig undersökning. Därför är utarbetandet av en hel montering av RPE en relevant teknik för in vivo-studier av utveckling och sjukdomar i ögat.

Dissekering av denna lilla vävnaden är mycket knepigt i början. Det är viktigt att vara avslappnad och upprätthålla korrekt hållning och placering som visas i denna video artikeln. Om en hel montera RPE ser ut som ett lyckohjul, detta eftersom långa nedskärningar inte gjordes i linje med diametern, dvs inte vinkelrätt mot en tangent. Detta är mest sannolikt att uppstå när saxen inte hålls framför och vinkelrätt från kroppen. En taggiga utseende till långa snitt beror sannolikt på en lätt återkallande av sax bladen mellan nedskärningar.

En grov eller robust utseende RPE ytan inte är normalt och kan bero på skador orsakade av ovarsam hantering av provet. Skador kan verifieras med phalloidin färgning. Vit eller tydliga fläckar är hål i RPE och den underliggande åderhinnan, orsakas också av ovarsam hantering eller punktering.

Om RPE visas grov och ogenomskinlig, är detta sannolikt på resterna av neurala näthinnan. Detta kan inträffa om ögonen är under-eller över-fast (mindre än 2 timmar, mer än 4 timmar på 4% PFA). Detta kan också inträffa i ordentligt fastsatta ögon som lagrats för ett alltför tid (> 6 månader). Dispase behandling kan användas för att avlägsna sådana rester, men kan också orsaka RPE att bryta upp.

Upptäcka fysiska skador på RPE är mycket svårt i utspädd eller albino prover. Vi rekommenderar phalloidin färgning på dina tidiga dissektioner så du kan se eventuella skador som kan ha uppstått på grund av hanteringen. För att göra detta, block för 1 timme med 200μL 2% BSA i 1XPBS i en mikro centrifugrör. Lägg sedan 2μL phalloidin och inkubera i mörker vid rumstemperatur i 20 minuter. Tvätta sedan 3x med 1 mL 1XPBS i 30 minuter vardera rumstemp i mörkret. Montera bilderna som vanligt. * Obs: fläcken är mycket ljus och vi rekommenderar inte att använda flouramount eller liknande flourescence-bevara media.

Trots alla varna, är en hel montera RPE inte särskilt känsliga och kan lätt tål hantering krävs för att utföra dissektion, färgning, immunohistokemi eller immunofluorescens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
straight forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4903	tip: .08 x .04 mm material: INOX
45° forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	tip: .05 x.01 mm material: INOX
15° "up" forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045A	tip: .1 x.06 mm material: INOX
spring scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5604	comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel
binocular dissecting microscope	Carl Zeiss, Inc.	Discovery V.8	use reflected light source
phalloidin	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546