Användningen av NanoDrop microvolume system som praktiska och effektiva alternativ till traditionell nukleinsyra kvantifiering metod beskrivs genom demonstration av två microvolume nukleinsyra protokoll syra kvantifiering.
Biomolekylära analyser utvecklas ständigt som använder allt mindre mängder av material, ofta hindrar användningen av konventionella kyvett styrmedel för nukleinsyra kvantifiering för dem som kan utföra microvolume kvantifiering.
Den NanoDrop microvolume prov retention system (Thermo Scientific NanoDrop produkter) funktioner genom att kombinera fiberoptisk teknik och naturliga ytegenskaper spänning för att fånga och behålla små mängder av provet oberoende av traditionella inneslutning anordning såsom kyvetter eller kapillärer. Dessutom använder systemet kortare väglängd, vilket resulterar i ett brett spektrum av nukleinsyra mätningar syrakoncentration, huvudsakligen eliminerar behovet av att utföra spädningar. Att minska mängden av provet som krävs för spektroskopiska analyser underlättar också införandet av ytterligare åtgärder för kvalitetskontroll under många molekylära arbetsflöden, öka effektiviteten och slutligen leder till större förtroende i efterföljande resultat.
Behovet av högkänsliga fluorescerande analys av begränsad massa har också dykt upp med de senaste experimentella framstegen. Med samma microvolume prov retention-teknik, kan fluorescerande mätningar utföras med 2 mikroliter av material, vilket gör fluorescerande analyser volym krav som måste minskas betydligt. Sådana microreactions av 10 mikroliter eller mindre är nu möjligt att använda en dedikerad microvolume fluorospectrometer.
Två microvolume nukleinsyra kvantifiering protokoll kommer att visas som använder integrerade system prov retention praktiska alternativ till traditionella kyvett-baserade protokoll. För det första är en direkt A260 absorbansen metoden i ett microvolume spektrofotometer beskrivs. Detta följs av en demonstration av en fluorescens-baserad metod som möjliggör minskade volymer fluorescens reaktioner med en microvolume fluorospectrometer. Dessa nya tekniker möjliggöra bedömningen av nukleinsyra koncentrationer från 1 pg / mikroliter till 15.000 ng / mikroliter med minimal förbrukning av prov.
Kvantitering protokollen som presenteras här är baserade på den mest accepterade microvolume system. Sådana system ger praktiska alternativ för traditionella nukleinsyra kvantifiering metodik, som förlitar sig på större prov volymer och användning av inneslutning apparater.
NanoDrop microvolume tekniken använder ett system prov bevarande som bygger på egenskaperna ytspänningen av provet som mäts för att bilda en vätska kolumn. Det är viktigt att provet kommer i kontakt med övre och nedre optisk mätning ytor för korrekt kolumn bildas. Om det vid något tillfälle mätresultaten verkar vara felaktiga eller inte reproducerbar, är det sannolikt ett resultat av prov heterogenitet eller flytande kolumnen brott.
Tvätt-och isopropylalkohol rekommenderas inte rengöringsmedel eftersom de kan uncondition ytorna piedestal mätningen. En obetingad piedestal uppstår när de hydrofoba ytegenskaper av sockeln har äventyrats, vilket resulterar i en utplaning av provet droppen. Obetingade piedestaler kan leda till brott av vätskan kolumnen under mätningen.
Figur 3. Obetingade yta kännetecknas av en flackare en vattendroppe.
Uncondtioned piedestal ytor kan renoveras med hjälp av NanoDrop sockel Renovering Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Ett tunt lager av rekonditionering förening appliceras på övre och nedre piedestal ytor, få torka ~ 30 sekunder och sedan gnuggas bort med en ren, torr, luddfri lab torka. Ett framgångsrikt rekonditionerade tillståndet kännetecknas av en vattendroppe beading upp när den tillämpas till botten piedestal ytan.
Figur 4. En renoverad yta kännetecknas av en beading av en vattendroppe.
Microvolume kvantifiering system minskar kraftigt prov konsumtion och dramatiskt öka koncentrationen intervallet jämfört med mer traditionella kvantifiering system. Även microvolume kvantifiering har blivit ofta en möjliggörande teknik för omständigheter som innebär begränsad cellmassan som nål biopsier och laser-capture microdissection, effektivitet och enkel användning av denna metod har gjort det ett allmänt accepterat alternativ till traditionella nukleinsyra metoder kvantifiering även När provet är riklig.
The authors have nothing to disclose.
Richard W. Beringer och David L. Ask, Program Forskare, Thermo Scientific NanoDrop produkter, tekniskt stöd och filmning.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | ||
NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific | ND-3300 |