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Biology

NanoDrop न्यूक्लिक एसिड की Microvolume quantitation

doi: 10.3791/2565 Published: November 22, 2010

Summary

पारंपरिक न्यूक्लिक एसिड quantitation पद्धति को व्यावहारिक और कुशल विकल्प के रूप में NanoDrop microvolume सिस्टम का उपयोग दो microvolume न्यूक्लिक एसिड quantitation प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के माध्यम से वर्णित है.

Abstract

Biomolecular assays विकसित कर रहे हैं लगातार किया जा रहा है कि सामग्री का उत्तरोत्तर छोटे मात्रा का उपयोग करें, अक्सर उन लोगों के लिए है कि microvolume quantitation प्रदर्शन कर सकते हैं न्यूक्लिक एसिड quantitation लिए पारंपरिक क्युवेट आधारित उपकरणों के उपयोग precluding.

NanoDrop microvolume नमूना प्रतिधारण प्रणाली (थर्मो वैज्ञानिक NanoDrop उत्पाद) पर कब्जा करने और cuvettes या capillaries जैसे पारंपरिक रोकथाम तंत्र के स्वतंत्र नमूना मिनट मात्रा को बनाए रखने के लिए फाइबर ऑप्टिक प्रौद्योगिकी और प्राकृतिक सतह तनाव गुणों के संयोजन द्वारा कार्य. इसके अलावा, सिस्टम छोटे पथ लंबाई, जो न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता माप की एक विस्तृत रेंज में परिणाम को रोजगार अनिवार्य रूप से dilutions प्रदर्शन करने की जरूरत को नष्ट करने. नमूना स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए आवश्यक की मात्रा को कम करना भी कई आणविक वर्कफ़्लोज़ भर में अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण कदम के शामिल किए जाने की सुविधा, कार्यकुशलता बढ़ाने और अंततः बहाव के परिणामों में अधिक से अधिक आत्मविश्वास के लिए अग्रणी.

हाल ही में प्रयोगात्मक अग्रिमों के साथ उच्च संवेदनशीलता सीमित द्रव्यमान का फ्लोरोसेंट विश्लेषण के लिए की जरूरत भी उभरा है. वही microvolume नमूना प्रतिधारण तकनीक का प्रयोग, फ्लोरोसेंट माप सामग्री के 2 μL के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट assays मात्रा आवश्यकताओं को काफी कम किया जा अनुमति है. 10 या उससे कम μL के इस तरह के microreactions अब संभव है एक समर्पित microvolume fluorospectrometer का उपयोग कर.

दो microvolume न्यूक्लिक एसिड quantitation प्रोटोकॉल का प्रदर्शन हो सकता है कि पारंपरिक क्युवेट आधारित प्रोटोकॉल के लिए व्यावहारिक विकल्प के रूप में एकीकृत नमूना प्रतिधारण प्रणाली का उपयोग करेगा. सबसे पहले, एक प्रत्यक्ष A260 absorbance एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग विधि वर्णित है. इस प्रतिदीप्ति आधारित एक विधि है कि एक microvolume fluorospectrometer के साथ सक्षम बनाता है कम मात्रा प्रतिदीप्ति प्रतिक्रियाओं के एक प्रदर्शन के द्वारा पीछा किया जाता है. ये उपन्यास तकनीक न्यूक्लिक एसिड 1 से / स्नातकोत्तर μL 15,000 / नमूना के न्यूनतम खपत के साथ एनजी μL लेकर सांद्रता का आकलन सक्षम.

Protocol

1. Microvolume न्यूक्लिक एसिड मात्रा का उपयोग एक NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर

  1. शुरू करने के लिए, निचले ऑप्टिकल सतह पर साफ विआयनीकृत पानी की 2 से 3 μL pipetting द्वारा microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर नमूना प्रतिधारण प्रणाली के ऊपरी और निचले ऑप्टिकल सतहों को साफ.
  2. लीवर हाथ को बंद करें, सुनिश्चित करना है कि ऊपरी कुरसी विआयनीकृत जल के साथ संपर्क में आता है. लीवर हाथ लिफ्ट और एक साफ, सूखे, एक प्रकार का वृक्ष मुक्त प्रयोगशाला पोंछ के साथ दोनों ऑप्टिकल सतहों पोंछ.
  3. NanoDrop सॉफ्टवेयर खोलें और न्यूक्लिक एसिड आवेदन का चयन करें. एक छोटे मात्रा, कैलिब्रेटेड pipettor प्रयोग निचले ऑप्टिकल सतह पर 1 बफर की μL वितरण द्वारा एक रिक्त माप प्रदर्शन. लीवर हाथ लोअर और न्यूक्लिक एसिड आवेदन में "खाली" का चयन करें.
  4. एक बार खाली माप पूरा हो गया है, एक साफ, सूखे, एक प्रकार का वृक्ष मुक्त प्रयोगशाला पोंछ के साथ दोनों ऑप्टिकल सतहों को साफ.
  5. नमूना है कि मापा जा रहा है के लिए उपयुक्त निरंतर चुनें.
    नमूना प्रकार विकल्प का चयन करें एकाग्रता परिकलित खेतों में प्रयुक्त किए गए लगातार
    dsDNA डीएनए 50 50
    ssDNA डीएनए 33 33
    शाही सेना आरएनए 40 40
    Oligo रिवाज 15-150
    तालिका 1 ठेठ प्रत्यक्ष A280 absorbance के माप का उपयोग कर एक NanoDrop microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, एक पारंपरिक क्युवेट आधारित एक TrayCell सूक्ष्म क्युवेट के साथ इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, और PicoGreen परख के साथ संयोजन के रूप में एक microvolume NanoDrop fluorospectrometer के लिए न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता पर्वतमाला .
  6. कम ऑप्टिकल कुरसी पर न्यूक्लिक एसिड नमूना के 1 μL बांटना और लीवर हाथ बंद. क्योंकि माप स्वतंत्र मात्रा है, नमूना केवल एक करने के लिए बनाया जा माप के लिए दो ऑप्टिकल सतहों के बीच खाई पाटने की जरूरत है.
  7. अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर में "उपाय" का चयन करें. सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता और पवित्रता अनुपात की गणना करेगा. नमूना माप के बाद, वर्णक्रमीय उत्पादन की समीक्षा करें.
  8. सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता और पवित्रता अनुपात की गणना करेगा. नमूना माप के बाद, वर्णक्रमीय नमूना गुणवत्ता का आकलन करने के लिए छवि की समीक्षा करें.
  9. एक ठेठ न्यूक्लिक एसिड नमूना का एक बहुत विशिष्ट प्रोफ़ाइल होगा.
    चित्रा 1
    चित्रा 1 एक विशिष्ट nucleic एसिड नमूना एक बहुत विशिष्ट प्रोफ़ाइल होगा.
  10. विशिष्ट nucleic एसिड अलगाव तकनीक के साथ जुड़े contaminants के आम स्रोतों Phenol / Trizol और स्तंभ निष्कर्षण शामिल हैं. Phenol / Trizol निकासी के मामले में, अवशिष्ट अभिकर्मक संदूषण 220 240 एनएम के बीच असामान्य स्पेक्ट्रा के द्वारा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 260 से 280 एनएम क्षेत्र में बदलाव से संकेत दिया जा सकता है. इसके विपरीत, स्तंभ निष्कर्षण से अवशिष्ट guanidine 230 एनएम के पास एक शिखर और गर्त में लगभग 230 एनएम से 240 एनएम के लिए एक बदलाव के लिए योगदान कर सकते हैं.
    चित्रा 2
    चित्रा 2. नमूने बी और सी की चोटियों और troughs में बदलाव के रूप में नमूना एक वर्णन कैसे contaminants न्यूक्लिक एसिड नमूने के स्पेक्ट्रा को प्रभावित कर सकते हैं की तुलना में.
  11. सही नमूना गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, 260/280 या 260/230 अनुपात समग्र वर्णक्रमीय गुणवत्ता के साथ संयोजन में विश्लेषण किया जाना चाहिए. शुद्ध nucleic एसिड आम तौर पर 1.8 ~ 260/280 अनुपात और डीएनए और आरएनए के लिए ~ 2.0 के अनुपात 260/280 उपज क्रमश. यह अनुपात पीएच और रिक्त और नमूना माप बनाने के लिए इस्तेमाल बफर के ईओण ताकत पर निर्भर है. अम्लीय समाधान अनुपात 0.2-0.3 द्वारा के तहत प्रतिनिधित्व करेंगे, जबकि 0.2-0.3 द्वारा एक बुनियादी समाधान अनुपात अधिक का प्रतिनिधित्व करेंगे. गौरतलब अलग शुद्धता अनुपात प्रोटीन, फिनोल या अन्य contaminants पर या 280 एनएम के निकट जोरदार अवशोषित की उपस्थिति का संकेत हो सकता है. 260/230 शुद्धता अनुपात 1.8-2.2 की रेंज में एक "शुद्ध" न्यूक्लिक सामान्यतः एसिड के लिए मूल्यों के साथ एक डीएनए पवित्रता का एक दूसरा उपाय है. पवित्रता अनुपात है कि प्रत्याशित मानों की तुलना में काफी कम कर रहे हैं संकेत हो सकता है अलगाव तकनीक का इस्तेमाल आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
  12. NanoDrop spectrophotometers भी प्रत्यक्ष absorbance का उपयोग प्रोटीन या प्रोटीन वर्णमिति assays के द्वारा यों इस्तेमाल किया जा सकता है. उचित स्तंभ के गठन और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, 2 μl नमूने प्रोटीन के नमूने के लिए सलाह दी जाती है. निम्न जौव वीडियो देखें: Microvolume प्रोटीन एकाग्रता का प्रयोग निर्धारण NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

  1. उच्च संवेदनशीलता microvolume न्यूक्लिक एसिड NanoDrop 3300 उपयोग quantitation प्रदर्शित करने के लिए, एक PicoGreen प्रतिदीप्ति किट प्रयोग किया जाता है. शुरू करने के लिए, कमरे के तापमान के लिए किट मानकों और सभी न्यूक्लिक एसिड के नमूने संतुलित. प्रतिदीप्त नमूने प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं और एम्बर या एल्यूमीनियम लिपटे ट्यूब में रखा जाना चाहिए.
  2. सभी मानकों और नमूने PicoGreen काम कर समाधान है कि जरूरत होगी के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मापा जा के लिए पर्याप्त 1x ते बफर तैयार करें. Nuclease मुक्त निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पानी के साथ प्रदान ते 20x बफर गिराए द्वारा 1xTE बफर तैयार. रिएक्शन संस्करणों के रूप में छोटा रूप में 10 200 μL से उल रेंज कर सकते हैं. इस उदाहरण में, 10 μL प्रतिक्रिया मात्रा तैयार हो जाएगा.
  3. 2x nuclease मुक्त शीशियों या ट्यूब में अंतिम वांछित एकाग्रता पर serially पतला dsDNA मानकों तैयार करें. पतला dsDNA मानकों के प्रत्येक के एक व्यक्ति लेबल nuclease मुक्त एम्बर या पन्नी के कवर ट्यूब में 5 μL स्थानांतरण.
  4. विभाज्य उचित लेबल एम्बर nuclease मुक्त या पन्नी कवर ट्यूबों में 5 ब्याज की प्रत्येक dsDNA नमूना के μL.
  5. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार PicoGreen काम कर समाधान तैयार करें. प्रत्येक ट्यूब या तो एक मानक या ब्याज का नमूना है (इस उदाहरण में 5 μL) युक्त PicoGreen काम समाधान के एक बराबर मात्रा स्थानांतरण.
  6. 1x ते बफर और PicoGreen काम समाधान के बराबर मात्रा का मिश्रण करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण, जो एक संदर्भ समाधान के रूप में कार्य करता है तैयार.
  7. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब की सामग्री को अच्छी तरह से कोमल pipetting द्वारा मिक्स और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्रतिक्रियाओं का सेते हैं. सभी मानकों और नमूने माप से पहले एक ही तापमान के लिए equilibrated प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में तापमान से प्रभावित है चाहिए.
  8. साधन तैयार करने और माप प्रदर्शन करने के लिए, पहले नमूना प्रतिधारण प्रणाली के निचले और ऊपरी सतहों को साफ. Pipet कम ऑप्टिकल सतह पर 2 से 3 विआयनीकृत जल की μL, करीब तो लीवर हाथ खोलते हैं, और एक साफ, एक प्रकार का वृक्ष मुक्त के साथ ऊपरी और निचले pedestals के दाग, प्रयोगशाला पोछ लो. सतहों से पहले कार्यवाही के रूप में एक उत्तेजना स्रोत की उपस्थिति में एक प्रकार का वृक्ष प्रतिदीप्ति प्रदर्शन और माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कर सकते हैं एक प्रकार का वृक्ष से मुक्त कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  9. साधन सॉफ्टवेयर खोलें, "न्यूक्लिक एसिड" अनुप्रयोग का चयन करें, और "PicoGreen dsDNA" विकल्प का चयन करें.
  10. साधन को रिक्त करने के लिए, कम कुरसी 1x ते के 2 μL जोड़ने, बंद हाथ, और साधन सॉफ्टवेयर क्षेत्र में "खाली" का चयन करें. एक बार खाली पूरा हो गया है, नमूना प्रतिधारण प्रणाली के दोनों सतहों से रिक्त समाधान दाग.
  11. मिक्स कोमल pipetting द्वारा संदर्भ समाधान. कम कुरसी पर कम प्रतिधारण सुझावों, पिपेट 2 μL का प्रयोग और हाथ बंद.
  12. माप प्रकार में "संदर्भ" का चयन करें, और इच्छित इकाइयों का चयन करें. "उपाय" माप चक्र आरंभ करें क्लिक करें.
  13. जब माप चक्र पूरा हो गया है, हाथ खुला है और अच्छी तरह से बंद नमूना प्रतिधारण प्रणाली सतहों दाग. पांच से उपाय संदर्भ की replicates, प्रत्येक को दोहराने के लिए एक ताजा विभाज्य का उपयोग कर.
  14. अतिरिक्त मानकों के लिए एक मानक वक्र बनाने के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ. अप करने के लिए सात मानकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. सॉफ्टवेयर से पांच प्रत्येक मानक के लिए प्रतिकृति की दुकान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. मानकों के replicates एक मानक वक्र से जो नमूना सांद्रता स्वचालित रूप से निर्धारित कर रहे हैं उत्पन्न करने के लिए औसत रहे हैं.
  15. एक बार मानक वक्र पूरा हो गया है, "नमूने" टैब का चयन करें, संबंधित नमूना आईडी जानकारी दर्ज करें और प्रत्येक अज्ञात नमूना उपाय.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत quantitation प्रोटोकॉल सबसे व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं microvolume सिस्टम पर आधारित हैं. इस तरह की प्रणाली पारंपरिक न्यूक्लिक एसिड quantitation पद्धति के लिए व्यावहारिक विकल्प है, जो अधिक से अधिक नमूना मात्रा और नियंत्रण तंत्र के उपयोग पर भरोसा करते हैं प्रदान करते हैं.

NanoDrop microvolume प्रौद्योगिकी एक नमूना प्रतिधारण प्रणाली है कि एक तरल स्तंभ के रूप में मापा जा रहा नमूना की सतह तनाव गुणों पर निर्भर करता है कार्यरत हैं. यह आवश्यक है कि नमूना ऊपरी और निचले उचित स्तंभ गठन के लिए ऑप्टिकल माप सतहों के साथ संपर्क में आता है. यदि किसी भी बिंदु पर माप परिणाम गलत या प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं लगता है, यह सबसे अधिक संभावना नमूना विविधता या तरल स्तंभ टूटना का परिणाम है.

डिटर्जेंट और isopropyl शराब सफाई एजेंट के रूप में वे कुरसी माप सतहों uncondition सकता अनुशंसित नहीं हैं. एक असुविधाजनक कुरसी तब होता है जब पीठ के हाइड्रोफोबिक सतह के गुणों समझौता किया गया है, नमूना छोटी बूंद के एक सपाट में जिसके परिणामस्वरूप. असुविधाजनक pedestals के माप के दौरान तरल स्तंभ का टूटना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. असुविधाजनक एक छोटी बूंद पानी की एक सपाट सतह की विशेषता है.

Uncondtioned कुरसी सतहों NanoDrop कुरसी Reconditioning यौगिक (पीआर-1, थर्मो वैज्ञानिक NanoDrop उत्पाद) का उपयोग कर उसकी मरम्मत हो सकता है. ऊपरी और निचले कुरसी सतहों, ~ 30 सेकंड के लिए सूखे की अनुमति दी reconditioning परिसर की एक पतली परत लागू होता है, तो एक साफ, सूखे, एक प्रकार का वृक्ष मुक्त प्रयोगशाला पोंछ का उपयोग बंद मला. राज्य सफलतापूर्वक उसकी मरम्मत एक पानी ऊपर beading के जब नीचे कुरसी की सतह पर लागू छोटी बूंद की विशेषता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. उसकी मरम्मत सतह एक छोटी बूंद पानी के ऊपर एक beading के द्वारा विशेषता है.

Microvolume quantitation सिस्टम बहुत नमूना खपत को कम करने और नाटकीय रूप से एकाग्रता रेंज में वृद्धि जब और अधिक परंपरागत मात्रा का ठहराव सिस्टम की तुलना में. हालांकि microvolume quantitation अक्सर सीमित सुई बायोप्सी और लेजर कब्जा microdissection जैसे सेल जन, दक्षता और आसानी से इस पद्धति का उपयोग बना दिया है यह एक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं के लिए वैकल्पिक पारंपरिक न्यूक्लिक एसिड quantitation तरीकों को शामिल परिस्थितियों के लिए एक समर्थकारी प्रौद्योगिकी बन गया है भी जब नमूना बहुतायत से होता है.

Disclosures

फिलिप Desjardins और Debra Conklin थर्मो वैज्ञानिक NanoDrop उत्पाद, इंक कि इस आलेख में प्रयुक्त उपकरणों का उत्पादन द्वारा नियोजित कर रहे हैं.

Acknowledgments

रिचर्ड डब्ल्यू Beringer और डेविड एल ऐश, अनुप्रयोग, वैज्ञानिकों, तकनीकी सहायता और फिल्मांकन के लिए थर्मो वैज्ञानिक NanoDrop उत्पादों,.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-2000C
NanoDrop 3300 Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-3300

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References

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Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565, doi:10.3791/2565 (2010).More

Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565, doi:10.3791/2565 (2010).

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