Summary
El uso de sistemas de NanoDrop microvolumen como alternativa práctica y eficaz a la tradicional metodología de cuantificación de ácidos nucleicos se describe a través de la demostración de dos protocolos de ácido nucleico microvolumen cuantificación.
Abstract
Ensayos biomoleculares se están desarrollando continuamente que el uso de cantidades cada vez más pequeños de material, que a menudo impide el uso de cubetas convencionales basados en instrumentos para la cuantificación de ácidos nucleicos para aquellos que pueden realizar la cuantificación microvolumen.
La muestra NanoDrop microvolumen sistema de retención (Thermo Científico Productos NanoDrop) funciona mediante la combinación de la tecnología de fibra óptica y las propiedades naturales de la tensión superficial para captar y retener pequeñas cantidades de muestra independiente de los aparatos de contención tradicionales, tales como cubetas o capilares. Además, el sistema cuenta con más cortos recorridos, que se traducen en un amplio rango de mediciones de concentración de ácido nucleico, básicamente eliminando la necesidad de realizar diluciones. Reducir el volumen de muestra necesario para el análisis espectroscópico también facilita la inclusión de nuevas medidas de control de calidad a lo largo de muchos flujos de trabajo molecular, incrementando la eficiencia y en última instancia conduce a una mayor confianza en los resultados posteriores.
La necesidad de un análisis de alta sensibilidad fluorescentes de masa limitada también ha surgido con los últimos avances experimentales. Utilizando la tecnología de retención que microvolumen muestra, las mediciones de fluorescencia se puede realizar con 2 l de material, lo que permite fluorescentes requisitos de volumen de ensayos se redujo significativamente. Microreactions como de 10 l o menos, ahora es posible con una dedicada fluorospectrometer microvolumen.
Dos nucleicos microvolumen protocolos de cuantificación de ácidos se demostró que el uso integrado de sistemas de retención de la muestra como una alternativa práctica a los tradicionales protocolos basados en la cubeta. En primer lugar, un método directo A260 absorbancia con un espectrofotómetro microvolumen se describe. Esto es seguido por una demostración de un método de fluorescencia basada en que permite reducir volumen de las reacciones de fluorescencia con un fluorospectrometer microvolumen. Estas nuevas técnicas permiten la evaluación de las concentraciones de ácido nucleico que van de 1 pg / mL a 15.000 ng / l con un consumo mínimo de la muestra.
Protocol
1. Microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos El uso de un espectrofotómetro NanoDrop 2000c
- Para comenzar, limpiar las superficies ópticas superiores e inferiores del sistema de espectrofotómetro microvolumen retención de muestras con pipeta 2 a 3 l de agua desionizada limpia en la superficie inferior óptica.
- Cierre el brazo de palanca, asegurando que el pedestal superior entra en contacto con el agua destilada. Levante el brazo de palanca y limpie tanto las superficies ópticas con un paño limpio, seco y sin pelusa, un paño de laboratorio.
- Abra el software NanoDrop y seleccione la aplicación de ácidos nucleicos. Utilice un pequeño volumen, pipeta calibrada para realizar una medición en blanco mediante la supresión de un l de tampón sobre la superficie óptica inferior. Baje el brazo de palanca y seleccione "En blanco" en la aplicación de ácido nucleico.
- Una vez que la medición en blanco es completo, limpie las superficies ópticas con un paño limpio, seco y sin pelusa, un paño de laboratorio.
- Elija la constante apropiada para la muestra que se va a medir.
Tabla 1. Típicos rangos de concentración de ácido nucleico para dirigir A280 medidas de absorbancia con un espectrofotómetro NanoDrop microvolumen, una cubeta tradicionales basados en espectrofotómetro utilizado con una cubeta TrayCell microcelular, y un fluorospectrometer NanoDrop microvolumen junto con el ensayo PicoGreen.Tipo de muestra Seleccione la opción Constante que se utiliza para calcular la concentración dsDNA ADN-50 50 ssDNA ADN-33 33 ARN ARN-40 40 Oligo Costumbre 15-150 - Prescindir de una L de muestra de ácido nucleico en el pedestal óptica inferior y estrecha del brazo de palanca. Debido a que la medida es independiente de volumen, la muestra sólo tiene que cerrar la brecha entre las dos superficies ópticas para la medición a realizar.
- Seleccione "medida" en el software de aplicación. El software calcula automáticamente el ácido nucleico coeficientes de concentración y la pureza. Después de la medición de la muestra, revisar el espectro de salida.
- El software calcula automáticamente el ácido nucleico coeficientes de concentración y la pureza. Después de la medición de la muestra, revisar la imagen espectral para evaluar la calidad de la muestra.
- Un ejemplo típico de ácidos nucleicos tendrá un perfil muy característico.
Figura 1. Un ejemplo típico de ácidos nucleicos que tienen un perfil muy característico. - Las fuentes comunes de contaminantes asociados a las técnicas específicas de aislamiento de ácidos nucleicos incluyen extracción con fenol / Trizol y la columna. En el caso de extracción con fenol / Trizol, contaminación de los reactivos residuales puede ser indicado por espectros anormales entre 220-240 nm, así como por los cambios en la región de 260 nm a 280. Por el contrario, guanidina residual de la extracción de la columna puede contribuir a un pico cercano a 230 nm y un cambio en el canal de 230 nm a 240 nm aproximadamente.
Figura 2. Los cambios en los picos y valles de las muestras B y C, en comparación con la muestra A ilustrar cómo los contaminantes pueden afectar a los espectros de las muestras de ácido nucleico. - Para evaluar con precisión la calidad de la muestra, 260/280 o 260/230 ratios deben ser analizados en combinación con una calidad espectral global. Pura ácidos nucleicos generalmente producen una proporción 260/280 de ~ 1,8 y un ratio de 260/280 de ~ 2,0 para el ADN y ARN, respectivamente. Esta relación depende del pH y fuerza iónica del buffer usado para hacer que el blanco y las mediciones de la muestra. Las soluciones ácidas se subestima la relación de 0.2-0.3, mientras que una solución básica sobre-representar la proporción de 0,2-0,3. Relaciones de pureza significativamente diferentes pueden indicar la presencia de la proteína, los contaminantes fenol u otros que absorben fuertemente en o cerca de 280 nm. El índice de pureza del 260/230 es una segunda medida de la pureza del ADN con los valores de un ácido "puro" nucleicos comúnmente en el rango de 1.8-2.2. Relaciones de pureza que son significativamente inferiores a los valores esperados pueden indicar la técnica de aislamiento utilizada puede requerir una mayor optimización.
- Espectrofotómetros NanoDrop también puede ser utilizado para cuantificar las proteínas utilizando absorbancia directa o mediante ensayos colorimétricos proteínas. Para asegurar la formación adecuada y la reproducibilidad de columna, 2-l muestras se recomienda para las muestras de proteínas. Consulte el siguiente video de Jove: Proteína microvolumen determinación de la concentración con el espectrofotómetro NanoDrop http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610
- Para demostrar la alta sensibilidad microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos utilizando la NanoDrop 3300, un equipo de PicoGreen fluorescencia se utiliza. Para comenzar, se equilibran las normas kit y todas las muestras de ácidos nucleicos a temperatura ambiente. Muestras fluorescentes son sensibles a la luz y se debe mantener en ámbar o tubos de aluminio envuelto.
- Prepare el buffer TE 1x suficiente para todos los estándares y las muestras a medir, así como para la solución PicoGreen de trabajo que serán necesarios. Prepare el buffer de 1xTE diluyendo el siempre 20x buffer TE con agua libre de nucleasa por el protocolo del fabricante. Volúmenes de reacción puede variar desde 200 l hasta un mínimo de 10 ul. En este ejemplo, 10 volúmenes de reacción de l estará preparado.
- Prepare diluciones seriadas normas dsDNA a 2 veces la concentración final deseada en el libre de nucleasa frascos o tubos. La transferencia de 5 L de cada uno de los estándares de ADN de doble cadena diluye en un individuo marcado libre de nucleasa ámbar o forrada con papel aluminio tubo.
- Alícuota de 5 l de cada muestra de ADN de doble cadena de interés en un etiquetado apropiado libre de nucleasa ámbar o forrada con papel aluminio tubos.
- Preparar la solución PicoGreen trabajo de acuerdo con el protocolo del fabricante. La transferencia de un volumen igual de la solución PicoGreen de trabajo a cada tubo conteniendo un patrón o la muestra de interés (5 l en este ejemplo).
- Combinar volúmenes iguales de tampón TE 1x y la solución PicoGreen de trabajo para preparar el control negativo, que sirve como solución de referencia.
- Mezclar el contenido de cada tubo de reacción a fondo por pipeteo suave e incubar las reacciones a temperatura ambiente durante 5 minutos. Todos los estándares y las muestras deben ser equilibrados a la misma temperatura antes de la medición como señal de fluorescencia se ve afectada por la temperatura.
- Para preparar el instrumento y realizar las mediciones, primero limpiar las superficies superior e inferior del sistema de retención de la muestra. Pipeta de 2 a 3 l de agua destilada sobre la superficie óptica inferior, cerca a continuación, abra el brazo de palanca, y borra los pedestales superior e inferior con un paño limpio y sin pelusa, limpie de laboratorio. Asegúrese de que las superficies estén libres de pelusa antes de proceder como pelusas pueden presentar fluorescencia en presencia de una fuente de excitación y pueden interferir con la medición.
- Abra el software del equipo, seleccione la opción "Ácidos nucleicos" la aplicación y seleccionar la opción "PicoGreen-DNA de doble cadena" opción.
- En blanco del instrumento, añadir 2 l de TE 1x al pedestal inferior, cerca del brazo, y seleccione "En blanco" en el campo de instrumentos de software. Una vez que se completa en blanco, mancha de la solución en blanco en ambas superficies del sistema de retención de la muestra.
- Mezclar la solución de referencia por pipeteo suave. Utilizando puntas de baja retención, pipeta 2 l en el pedestal inferior y estrecha del brazo.
- Seleccione "referencia" en el tipo de medida y seleccionar las unidades deseadas. Haga clic en "medida" para iniciar el ciclo de medición.
- Cuando el ciclo de medición, abra el brazo y el fondo mancha las superficies de retención de muestra del sistema. Llegar a medir hasta cinco réplicas de la referencia, con una alícuota de cada réplica.
- Repita el proceso para las normas adicionales para construir una curva estándar. Hasta siete normas pueden ser utilizadas. El software está diseñado para almacenar un máximo de cinco repeticiones para cada estándar. Réplicas de las normas se promedian para generar una curva estándar a partir de la cual las concentraciones de la muestra se determina automáticamente.
- Una vez que la curva de calibración se ha completado, seleccione la opción "muestras", ingrese la información de la muestra correspondiente ID y medir cada muestra desconocida.
Discussion
Los protocolos de cuantificación que aquí se presenta se basa en la más aceptada sistemas microvolumen. Estos sistemas ofrecen alternativas prácticas para la tradicional metodología de cuantificación de ácidos nucleicos, que se basan en el volumen de la muestra mayor y el uso de aparatos de contención.
NanoDrop microvolumen tecnología emplea un sistema de retención de la muestra que se basa en las propiedades de tensión superficial de la muestra que se está midiendo para formar una columna de líquido. Es esencial que la muestra se pone en contacto con las superficies superior e inferior de medición óptico para la formación de la columna correcta. Si en algún momento los resultados de las mediciones parecen inexactos o no reproducible, lo más probable es el resultado de la heterogeneidad de la muestra o la rotura de columna de líquido.
Detergentes y el alcohol isopropílico no se recomiendan los agentes de limpieza, ya que pueden sin condiciones de las superficies de medición pedestal. Un pedestal incondicionada se produce cuando las propiedades de superficie hidrofóbica del pedestal se han comprometido, resultando en un aplanamiento de la gota de la muestra. Pedestales acondicionado puede conducir a la rotura de la columna de líquido durante la medición.
La superficie de la figura 3. Incondicionado se caracteriza por un aplanamiento de una gota de agua.
Superficies Uncondtioned pedestal pueden ser reacondicionadas con pedestal compuesto NanoDrop reacondicionamiento (PR-1, Thermo Scientific Productos NanoDrop). Una fina capa de compuesto de reacondicionamiento se aplica a las superficies superior e inferior del pedestal, se deja secar durante aproximadamente 30 segundos, y luego contagió con un paño limpio, seco y sin pelusa, un paño de laboratorio. Un estado con éxito reacondicionados se caracteriza por una gota de agua abalorios cuando se aplica a la superficie inferior del pedestal.
Figura 4. Una superficie reacondicionados se caracteriza por una partida de una gota de agua.
Sistemas de cuantificación microvolumen reducir en gran medida el consumo de la muestra y aumentar considerablemente el rango de concentración en comparación con los sistemas de cuantificación más tradicionales. Aunque la cuantificación microvolumen a menudo ha convertido en una tecnología que permite a circunstancias relacionadas con la masa de células limitados, tales como biopsias con aguja y microdisección láser de captura, la eficiencia y la facilidad de uso de esta metodología ha hecho que sea ampliamente aceptada alternativa a los métodos de cuantificación de ácidos nucleicos, incluso cuando la muestra es abundante.
Disclosures
Philippe Desjardins y Conklin Debra son empleados por los productos Thermo Scientific NanoDrop, Inc, que produce los instrumentos utilizados en este artículo.
Acknowledgments
Richard W. Beringer y David L. Ash, científicos de aplicaciones, productos de Thermo NanoDrop Ciencia, para la asistencia técnica y la filmación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-2000C | |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
References
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