Summary
克隆形成生殖可行性的评估检测的适用性已成立超过50年。在这里，我们展示了贴壁细胞进行克隆形成实验的一般程序。
Abstract
克隆形成（或菌落形成）检测已建立了超过50年;，原文件，描述该技术是在1956年1出版。除了 记录方法，初步具有里程碑意义的研究产生的X射线照射哺乳动物细胞（HeLa细胞）培养1的辐射剂量反应曲线。从根本上讲，克隆形成实验，使生殖可行性的差异（细胞产生的后代的能力，即一个单细胞，形成了50个或更多细胞的殖民地）的评估，经历了各种治疗方法，如曝光控制未经处理的细胞和细胞之间的电离辐射，各种化学化合物（如细胞毒性药物）或在其他情况下的遗传操纵。该试剂盒已成为辐射生物学中最广泛接受的技术，并已被广泛用于评估不同的细胞系的放射敏感性。此外，克隆形成实验是常用的监测辐射修改化合物的疗效，并为确定集落形成能力，在不同的细胞系，细胞毒性药物和其他抗癌疗法的影响。一个典型的形成群落的生存实验，使用贴壁细胞线涉及到三个不同的组件，1）单层细胞在组织培养瓶中治疗，2）制备单细胞悬液，电镀适当数量的细胞在培养皿中和3），固定和染色菌落相关的潜伏期之后，范围从1-3周，这取决于细胞系。在这里，我们展示了执行与使用同一个永生化人角质形成细胞线（FEP - 1811）2贴壁细胞系的克隆形成实验的一般程序。此外，我们的目的是描述克隆形成实验的共同特征，包括细胞对辐射的暴露后的电镀效率和生存分数的计算，并体现与使用的一种天然抗氧化剂配方辐射响应的修改。
Protocol
1。细胞培养和实验装置
- 人角质形成细胞保持在75厘米的2 - SFM角质形成细胞含有15毫升（K - SFM）的组织培养烧瓶单层培养基（GIBCO公司，无血清培养基）补充L -谷氨酰胺（2毫米），表皮生长因子（5纳克/毫升），牛垂体提取物（40微克/毫升）和20毫克/毫升的庆大霉素。细胞是生长在37℃饱和湿度5％的CO 2环境
- 细胞接种到12 × 25厘米2组织培养的K - SFM培养基中含有5毫升烧瓶。
单细胞悬液准备胰蛋白酶。细胞洗净，用磷酸盐缓冲液和0.05％胰蛋白酶/ EDTA 5-10分钟的解决方案孵育。当细胞开始变得圆润，3〜30％是分离的贝科的修改鹰含10％胎牛血清的介质卷被添加到中的胰蛋白酶。这些细胞被分离移液器向上和向下（20倍）。使用血球细胞计数。
接种相应的单元格的数字是根据细胞株人类FEP - 1811角质形成细胞（约20小时）的倍增时间。我们的目标是达到实验的日子〜90％汇合（〜10 6细胞每烧瓶） 。
12烧瓶组成的一个实验是为一个单一的克隆形成实验（6个未辐照的控制和六个照射烧瓶），它可以在大约四个小时完成的最佳选择。
2。治疗与辐射
- 一个适当的时候与有关辐射修改复合治疗的细胞和揭露细胞无论是γ-辐射或X射线电离辐射。
通常情况下，六个烧瓶作为电镀效率（治疗）和药物只控制。其他六个烧瓶照射。
在这个例子中，被视为人类角化细胞与不同浓度Cinnulin公积金（CPF;诚信保健品国际，春山，TN，美国为20μg/ mL的下面是有代表性的数据），一种水溶性天然抗氧化剂配方1小时，在37 ° C细胞使用的137 Cs源（1000 Gammacell精英辐照; Nordion公司国际上，加拿大1.6 GY /分钟）与4 Gy的照射。
3。电镀
- 治疗后，获得单细胞悬液，如前面所述。
- 每个样本中的细胞数量是使用血球计数仔细稀释等适当的手机号码接种到培养皿（五个每个复制15毫米的菜肴）。
电镀效率和/或存活分率决定细胞的数量，以每盘种子时，应当预见。目的是实现范围内有20 - 150菌落。
培养皿中被安排在一个加湿塑料克隆盒和5％的CO 2环境在37 ° C的集落形成。
集落形成的孵化时间，少则1-3周不同的细胞系，它被接受，必须相当于至少6个细胞分裂的时间。在这个例子中，对人类角质形成细胞的控制菜肴需要八天，以形成足够大的克隆，50个或更多的细胞组成。
4。固定和染色殖民地
在通风柜完成下列步骤。
- 吸轻轻地从每个板块中删除媒体。
- 用5 mL 0.9％生理盐水清洗每块板。
- 修复与5毫升10％中性缓冲15-30分钟的福尔马林溶液菌落。
- 染色5毫升0.01％（W / V）的水晶紫卫生署2 O为30-60分钟。
- DH 2 O洗净多余的水晶紫，让菜干。
5。菌落计数
体视显微镜
- 包含超过50个单个细胞的菌落计数使用立体显微镜。
数码成像和点票的使用成像软件
- 殖民地的数字图像获得使用照相机或扫描装置
- 菌落计数使用图像分析软件如下所述的软件包。
细胞计数使用ImageJ（斐济版本1.44a）
- 在斐济打开图像文件，转到文件 - >打开。
- 如果需要将图像转换为8位格式，图像 - >调整...->阈值。
- 调整阈值，以减少非特异性背景水平，使被检测到，只有殖民地。
- 计数菌落使用以下过程 - >二进制 - >查找最大值。
对于这种图像格式，可以设置噪声容限为0。确保浅色背景“选项被勾选预览检测的最大值，以检查所有细胞克隆已正确注册。
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Discussion
在这个例子中，人类的FEP - 1811角质形成细胞处理不同浓度高达100微克/毫升的中央公积金;数据显示为20微克/毫升中央公积金为1小时37 ° C。治疗后细胞使用的137 Cs源（1000 Gammacell精英辐照; Nordion公司国际上，加拿大1.6 GY /分钟）与4 Gy的照射。对于控制未经处理和药物治疗只有100个细胞接种在每个培养皿中，细胞每盘1000辐照样品镀。正如上述表格中所指出的，使用立体显微镜或数码图像（图1）菌落计数计数使用ImageJ。五菜的平均菌落数来计算电镀效率和存活率。数据表明辐射与天然抗氧化剂配方的保护作用（保护因子〜3）。
代表性的成果
| 治疗 | 计数方法 | 细胞镀 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 电镀Efficiency1 | 尚存 Fraction2 |
| 未经处理的细胞 | 手册 （立体显微镜） | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0.23 | 1 |
| 手册 （数字图像） | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0.23 | 1 | |
| 寻找千里马 （斐济） | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0.22 | 1 | |
| 20 mM的中央公积金 | 手册 （立体显微镜） | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0.15 | 0.66 |
| 手册 （数字图像） | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0.15 | 0.67 | |
| 寻找千里马 （斐济） | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0.15 | 0.65 | |
| 4戈瑞 | 手册 （立体显微镜） | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0.03 | 0.14 |
| 手册 （数字图像） | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| 寻找千里马 （斐济） | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| 20毫米的中央公积金+ 4戈瑞 | 手册 （立体显微镜） | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0.11 | 0.47 |
| 手册 （数字图像） | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0.11 | 0.45 | |
| 寻找千里马 （斐济） | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0.11 | 0.47 |
1电镀效率=菌落数计算/镀细胞的数量
2存活分率=（计算/细胞镀金数量的殖民地数）/电镀效率
电镀效率和生存和菌落计数的比较，使用各种方法计算见表 1。
图1。数字图像显示人类，FEP - 1811，电镀1000细胞的角质形成细胞和8天的潜伏期后产生的殖民地。 （一）细胞与4 Gy的照射和（二）细胞经1小时20微克/毫升中央公积金在37 ° C前4 Gy的照射。天然抗氧化剂配方与辐射保护作用是显而易见的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
澳大利亚核科学与工程学院的支持，是公认的事实。 TCK的是AINSE奖项的收件人。表观医学实验室是支持由国家卫生和澳大利亚的医学研究理事会（566559）。人力资源是由澳大利亚的研究生和BakerIDI明亮的火花奖。生物医学成像发展有限公司（CRC投标），建立和澳大利亚政府的合作研究中心计划下支持，这项工作是由“儿童权利公约”。 CO是收件人澳大利亚研究生奖和一个CRC投标补充奖学金。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
