Summary
Die Anwendbarkeit des klonogene Test zur Bewertung der reproduktiven Überlebensfähigkeit seit mehr als 50 Jahren etabliert. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zellen.
Abstract
Die klonogenen (oder koloniebildende)-Assay wurde für mehr als 50 Jahren besteht; die ursprüngliche Papier beschreibt die Technik wurde in 1956 1 veröffentlicht. Abgesehen von der Dokumentation der Methode erzielte das erste Meilenstein-Studie die erste Strahlung Dosis-Wirkungs-Kurve für X-ray bestrahlt Säugetieren (HeLa) Zellen in Kultur 1. Grundsätzlich ermöglicht die klonogene Test eine Bewertung der Unterschiede in der reproduktiven Lebensfähigkeit (Kapazität der Zellen auf die Nachkommen zu produzieren, dh eine einzelne Zelle, um eine Kolonie von 50 oder mehr Zellen zu bilden) zwischen Kontrolle unbehandelte Zellen und Zellen, die verschiedene Behandlungen wie Belichtung unterzogen haben auf ionisierende Strahlung, verschiedene chemische Verbindungen (zB Zytostatika) oder in anderen Fällen genetische Manipulation. Der Test hat sich die am weitesten akzeptierte Methode in der Strahlenbiologie und wurde vielfach zur Beurteilung der Strahlenempfindlichkeit verschiedener Zelllinien verwendet. Weiterhin ist die klonogenen allgemein zur Überwachung der Wirksamkeit von Strahlung modifizierende Verbindungen und zur Bestimmung der Wirkung von Zytostatika und anderen Anti-Krebs-Therapeutika auf Basis der Kolonie-bildende Fähigkeit, in verschiedene Zelllinien verwendet. Ein typisches klonogenen Überleben Experiment mit adhärenten Zellen Zeilen umfasst drei Komponenten, 1) Behandlung der Zellrasen in Zellkulturflaschen, 2) Vorbereitung der einzelnen Zellsuspensionen und Beschichtung eine entsprechende Anzahl von Zellen in Petrischalen und 3) Fixierung und Färbung Kolonien nach einer entsprechenden Inkubationszeit könnte, die von 1-3 Wochen liegen, je nach Zelllinie. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zelllinien mit dem Einsatz von einer immortalisierten humanen Keratinozyten-Zelllinie (FEP-1811) 2. Auch sind unsere Ziele zu gemeinsamen Merkmale der klonogenen Assays einschließlich Berechnung der Platierungseffizienz und Überleben Fraktionen nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung zu beschreiben, und Änderungen der Strahlung-Response mit dem Einsatz von ein natürliches Antioxidans Formulierung zu veranschaulichen.
Protocol
1. Cell Culture and Experimental Set-up
- Menschliche Keratinozyten werden als Monolayer in 75 cm 2 Zellkulturflaschen mit 15 ml Keratinozyten-SFM (K-SFM) gepflegt Medium (Gibco, serum-freiem Medium) mit L-Glutamin (2 mM), epidermal growth factor (5 ng ergänzt / mL), Rinder-Hypophysen-Extrakt (40 ug / ml) und 20 mg / mL Gentamicin. Die Zellen werden in einer befeuchteten 5% CO 2-Umgebung bei 37 ° C.
- Die Zellen werden in 12 x 25 cm 2 Zellkulturflaschen mit 5 ml K-SFM Medium ausgesät.
Einzel-Zell-Suspensionen werden durch Trypsinierung vorbereitet. Die Zellen werden gewaschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung resuspendiert und mit einer 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung für 5-10 Minuten. Wenn die Zellen zu starten gerundet und ~ 30% sind freistehend, 3 Bände Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum hinzugefügt, um das Trypsin zu neutralisieren. Die Zellen werden durch Auf-und Abpipettieren (20 mal) abgelöst. Die Zellen werden gezählt unter Verwendung einer Zählkammer.
Entsprechende Zellzahlen werden nach der Verdopplungszeit der Zell-Linie (ca. 20 Stunden für den menschlichen FEP-1811 Keratinozyten) ausgesät. Ziel ist es, ~ 90% Konfluenz (~ 10 6 Zellen pro Flasche) am Tag des Experiments zu erreichen.
Ein Experiment, bestehend aus 12 Flaschen ist optimal für ein einzelnes klonogene Test (sechs unbestrahlten Kontrolle und sechs bestrahlten Kolben), die in etwa vier Stunden abgeschlossen werden kann.
2. Behandlung und Bestrahlung
- Treat-Zellen für eine angemessene Zeit mit einer entsprechenden Strahlung modifizierenden Verbindung und setzen Zellen gegenüber ionisierender Strahlung entweder γ-Strahlung oder Röntgenstrahlung.
In der Regel sechs Flaschen dienen als Platierungseffizienz (unbehandelt) und Medikament nur Kontrollen. Die anderen sechs Flaschen werden bestrahlt.
, Eine wasserlösliche natürliche Antioxidans Formulierung, für 1 Stunde in diesem Beispiel humaner Keratinozyten mit verschiedenen Konzentrationen von Cinnulin PF (; Integrität Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, USA repräsentative Daten für 20 ug / mL ist unten dargestellt CPF) behandelt bei 37 ° C. Die Zellen werden mit 4 Gy mit einer 137 Cs-Quelle (; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min Gammacell 1000 Elite Strahler) bestrahlt.
3. Plating
- Nach der Behandlung werden einzelne Zellsuspensionen erhalten, wie oben beschrieben.
- Die Anzahl der Zellen in jeder Probe gezählt werden vorsichtig mit einer Zählkammer und so verdünnt, dass geeignete Zellzahlen in Petrischalen ausgesät werden (fünf Wiederholungen der einzelnen in 15 mm Schalen).
Die Platierungseffizienz und / oder überlebenden Anteil sollte erwarten, wenn die Entscheidung die Anzahl der Zellen, um Samen pro Platte werden. Das Ziel ist es, einen Bereich zwischen 20 erreichen - 150 Kolonien.
Petrischalen werden in einem befeuchteten Kunststoff Klonen Feld angeordnet und inkubiert in einer 5% CO 2-Umgebung bei 37 ° C für Kolonie-Bildung.
Die Inkubationszeit für Koloniebildung variiert von 1-3 Wochen für die verschiedenen Zelllinien, es wird angenommen, dass die Zeit entsprechen müssen mindestens sechs Zellteilungen. In diesem Beispiel erfordern die Kontrolle Gerichte für die menschliche Keratinozyten acht Tage, um ausreichend große Klone, bestehend aus 50 oder mehr Zellen zu bilden.
4. Fixierung und Färbung Colonies
Führen Sie die folgenden Schritte in einer Abzugshaube.
- Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jeder der Platten durch Aspiration.
- Wash jede Platte mit 5 ml 0,9% iger Kochsalzlösung.
- Fix die Kolonien mit 5 ml 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung für 15-30 Minuten.
- Stain mit 5 ml 0,01% (w / v) Kristallviolett in dH 2 O für 30-60 Minuten.
- Wash überschüssige Kristallviolett mit dH 2 O und ermöglichen Geschirr nicht richtig getrocknet.
5. Colony Counting
Stereomikroskop
- Kolonien mit mehr als 50 einzelnen Zellen werden gezählt mit einem Stereomikroskop.
Digital Imaging und Zählen mit Imaging-Software
- Digitale Bilder von den Kolonien werden unter Verwendung einer Kamera oder einem Scanner
- Kolonien gezählt mit bildgebenden Analyse-Software-Pakete wie unten beschrieben.
Zellzählung mit ImageJ (Fidschi Version 1.44a)
- Öffnen Sie die Bilddatei in Fiji, gehen Sie zu File -> Open.
- > Anpassen ...-> Threshold - Bei Bedarf konvertieren Sie das Bild in 8-Bit-Format, um Bild zu gehen.
- Passen Schwelle auf ein Niveau von unspezifischen Hintergrund zu reduzieren, so dass nur die Kolonien erkannt werden.
- Graf Kolonien mit den folgenden: go to Process -> Binary -> Find Maxima.
Für dieses Bildformat, kann Rausch Toleranz auf 0 gesetzt werden. Stellen Sie sicher, dass hellem Hintergrund Option aktiviert ist und eine Vorschau der erkannt Maxima zu prüfen, ob alle Zellkolonien wurden korrekt registriert.
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Discussion
In diesem Beispiel menschliche FEP-1811 Keratinozyten wurden mit verschiedenen Konzentrationen von bis zu 100 pg / mL CPF behandelt; Daten werden für 20 ug / mL CPF für 1 Stunde bei 37 ° C gezeigt Nach der Behandlung wurden die Zellen mit 4 Gy mit einer 137 Cs-Quelle (; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min Gammacell 1000 Elite Strahler) bestrahlt. Für die Kontrolle unbehandelt und Drogen nur Behandlungen 100 Zellen wurden in jeder Petrischale und 1000 Zellen pro Schale wurden die bestrahlten Proben beschichtet. Wie in der obigen Tabelle angegeben ist, wurden die Kolonien gezählt wurden mit einem Stereomikroskop oder digitale Bilder (Abb. 1) für die Zählung mit ImageJ genommen. Die durchschnittliche Koloniezahl für die fünf Gerichte verwendet wurde, um Platierungseffizienz und überlebende Teil zu berechnen. Die Daten zeigten eine Strahlung schützende Wirkung (Schutz-Faktor ~ 3) mit dem natürlichen Antioxidans Formulierung.
Repräsentative Ergebnisse
| Behandlung | Zählmethode | Zell-plated | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Plating Efficiency1 | Surviving Fraction2 |
| Unbehandelten Zellen | Handbuch (Stereomikroskop) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0,23 | 1 |
| Handbuch (Digitales Bild) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0,23 | 1 | |
| Suche Maxima (Fidschi) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0,22 | 1 | |
| 20 mM CPF | Handbuch (Stereomikroskop) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0,15 | 0,66 |
| Handbuch (Digitales Bild) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0,15 | 0,67 | |
| Suche Maxima (Fidschi) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0,15 | 0,65 | |
| 4 Gy | Handbuch (Stereomikroskop) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0,03 | 0,14 |
| Handbuch (Digitales Bild) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| Suche Maxima (Fidschi) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| 20 mM CPF + 4 Gy | Handbuch (Stereomikroskop) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0,11 | 0,47 |
| Handbuch (Digitales Bild) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0,11 | 0,45 | |
| Suche Maxima (Fidschi) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0,11 | 0,47 |
1 Galvanisierstift Effizienz = Anzahl der gezählten Kolonien / Anzahl der Zellen ausplattiert
2 Surviving Anteil = (Anzahl der gezählten Kolonien / Anzahl der Zellen vernickelt) / Platierungseffizienz
Tabelle 1. Berechnung der Platierungseffizienz und das Überleben und den Vergleich der Koloniezahlen mit verschiedenen Methoden
Abbildung 1. Digitales Bild zeigt Kolonien, die von Mensch, FEP-1811, Keratinozyten folgenden Beschichtung von 1000 Zellen und acht Tagen Inkubation produziert. (A) Die Zellen wurden mit 4 Gy bestrahlt und (B) Zellen wurden mit 20 ug / mL CPF für 1 Stunde bei 37 ° C vor der Bestrahlung mit 4 Gy behandelt. A-Strahlung schützende Wirkung mit dem natürlichen Antioxidans Formulierung ist offensichtlich.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. HR wird von einer australischen Post-Graduate-und BakerIDI hellen Funken Auszeichnungen unterstützt. Diese Arbeit wird durch die CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), gegründet und unterstützt unter der australischen Regierung Cooperative Research Centres-Programm finanziert. CO ist der Empfänger einer australischen Post-Graduate-Award und eine CRC-BID zusätzlichen Stipendium.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
