Summary
وقت التصوير انقضاء زراعة الأنسجة 3D يسمح بدراسة سلوك الهجرة من الخلايا الفردية النابعة من سماحة العقدية كرد فعل لاستخراج البروتين مجزأة من القشرة الدماغية.
Abstract
الهجرة من الخلايا هي عملية مشتركة تؤدي الى تطوير ونضوج النظام العصبي المركزي الفقاريات (Hatten ، '99). قشرة الدماغ تتكون من نوعين العصبية الأساسية : مثير والمثبطة. تنشأ هذه الخلايا في مناطق متميزة والهجرة الى القشرة على طول مسارات مختلفة (بيرلمان وآخرون ، '98). interneurons المثبطة تهاجر من مصادر هامشية تحت القشرية ، ومعظمهم من مناطق مختلفة من الفضيلة العقدية (غيلمان وآخرون ، '09؛ شو وآخرون ،'04). يتطلب مراقبة حركتهم spatiotemporal الدقيقة التي تفرضها منبهات البيئية ، للسماح لإنشاء التهندس الخلوي السليم والربط في القشرة الدماغية (Caviness وراكيتش ، '78؛ Hatten ،'90 ؛ راكيتش ، '90). لدراسة سلوك المهاجرة من الخلايا المتولدة في المناطق التكاثري للالبوارز العقدية (GE) في حديثي الولادة قوارض في المختبر استخدمنا 3 الترتيب الثقافة الأبعاد في مصفوفة Matrigel دينار بحريني. تألف الإعداد ثقافة explants GE اثنين ومصدرا للبروتينات اختبار المستخرج من قشرة الدماغ وكثف على الفلورسنت التاسع Retrobeads اللاتكس المتمركزة بين explants (Hasling آخرون ، '03؛ ريدل وآخرون ،'97). بعد 2-3 أيام من الثقافة ، وتبدأ الخلايا لتظهر على حافة يزدرع يظهر الميل إلى ترك الأنسجة في اتجاه شعاعي. التصوير مسموح يعيش رصد أنماط الهجرة من دون ضرورة لوضع العلامات أو الوسم الخلايا. عرض GE الخلايا عند تعرضها للكسور من البروتين الحصول عليها من استخراج القشرة isochronic النمس ، والسلوكيات المختلفة والحكم عليها من خلال التحليل الكمي لالحركية الفردية خلايا تتحرك.
Protocol
1. كاشف إعداد
- ذوبان الجليد المجمدة Matrigel على الرطب ، وترك ما يكفي من الوقت قبل التجربة (لا تسرع العملية عن طريق الانحباس الحراري النشط). Matrigel يستخدم لإنشاء بيئة 3D تشبه عن كثب مصفوفة خارج الخلية المؤدية إلى الهجرة من الخلايا. أنها توفر الخلايا مع كل ركيزة والميكانيكية التغليف. يتم تخزين Matrigel المجمدة في -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، يجب أن تكون عليه تدريجا حتى درجة حرارة 0-4 درجة مئوية ، أي إذابة الجليد على الرطب أو في الثلاجة. Matrigel مجموعات لا رجعة فيه لتشكيل هلام في درجة حرارة الحضانة (37 درجة مئوية). لذا فمن غير المستحسن لتسريع ذوبان بغمر الحاويات في المياه الدافئة.
- وتعد كسور البروتين من خلال التركيز كهرساوي (IEF) من استخراج البروتين الكلي من قشرة الدماغ من 0 يوم بعد الولادة (P0) النمس. بعد الانفصال ، ومدال الكسور بين عشية وضحاها ضد pH7.2 تريس ، حمض الهيدروكلوريك 20mM لتنظيف مقتطفات من مكونات عازلة التركيز ، والتي قد تكون سامة للأنسجة.
- وكثف البروتين نظام التسليم. البروتينات المستخرجة من قشرة الدماغ على حبات الفلورسنت التي اللاتكس ثم حرر ببطء إلى environment.We البروتينات وجدت أن ميزة مضان يساعد في معالجة البصرية المجهرية ويسمح الكشف عن الآثار غير المباشرة من السهل حتى الحد الأدنى من موقع حبة وديعة ، وعندما لاحظ تحت المجهر الفلورسنت.
- إضافة 10μl من الخرز الفلورسنت ل200μl - 100 من محلول البروتين
- لاحتضان 30min في الظلام في RT على شاكر
- تدور الخرز عليها في جهاز للطرد المركزي لمقاعد البدلاء 1hr بسرعة قصوى
- إزالة طاف
- في دوامة باستخدام 10μl متوسطة جديدة ، إعادة تعليق
- إضافة 30μl من Matrigel إلى تعليق ، ومزيج جيد ، ومكان على الجليد.
- المخازن ووسائل الإعلام
- إعداد والترشيح تعقيم - الاصطناعي السائل النخاعي (aCSF ؛ 124mM كلوريد الصوديوم ، NaHCO 26mM 3 ، 2 ص 4 ناه 1.2mM ، بوكل 3.2mM ، MgSO 4 1.2mM ، CaCl 2 2.4mM ، 10MM الجلوكوز). تبذير للتجمد في aCSF مسبقا ، بحيث يكون جاهزا في وقت تشريح الأنسجة. لجعله ، ضع قارورة بلاستيكية مملوءة aCSF العقيمة في الفريزر -80 درجة مئوية. رصد تجميد كل ذلك في كثير من الأحيان ، وذلك عندما طبقة من الجليد يتراكم في داخل الجدار ، وانكساره والاختلاط مع السائل. كرر حتى قارورة تحتوي معظمها طين الجليدية. أعد العازلة بهذه الطريقة ليس فقط تؤيد بقاء الأنسجة ، ولكن سوف يعقد أيضا درجة حرارة منخفضة لفترة أطول ، وميكانيكيا أقل ضررا للأنسجة من مكعبات الثلج مكتنزة.
- إعداد المتوسطة Neurobasal مع N - 2 و B - 27. الملاحق المضافة وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة ، فضلا عن 1mg/100ml الجنتاميسين ، 2 مم L - الجلوتامين ، والجلوكوز بنسبة 0.6 ٪ تعقيم عن طريق الترشيح من خلال غشاء 0.22μm. الدفء عند 37 درجة مئوية حتى استخدام.
- الثقافة لوحات
- وتعد ثقافة الصف البلاستيكية ستة جيدا لوحات بواسطة تنقيط كل بئر في وسطها مع كمية صغيرة (حوالي 2μl) من Matrigel الباردة باستخدام 20μl ماصة الحافة ، وتعقيمها مما يشكل الجولة ساترة 18mm الزجاج في كل قطرة. لا لوحات ولا coverslips على ضرورة أن يكون خلاف ذلك ثقافة المعالجة.
2. تحضير الأنسجة
- الحصول على أنسجة المخ
- بعد التخدير العميق مع Euthasol الحيوان ، وإزالة المخ وضعه في الثلج الباردة aCSF
- فصل نصفي الكرة مع مشرط وشريحة coronally في 500μm باستخدام جهاز للاختيار ، وجمع شرائح في صحن صغير يحتوي على الجليد الباردة aCSF
- جعل explants (استخدام مجهر تشريح)
- تحديد الشرائح التي تحتوي على الفضيلة العقدية (GE) والمناطق تقليم من القشرة التي قد تلتف على شركة جنرال الكتريك ، وتتداخل مع اتخاذ مزيد من الخطوات
- اضغط على هاريس أحادي النواة يحمل في منطقة قريبة من سطح البطين من جنرال الكتريك ، والتراجع عن نواة تحتوي في الغالب منطقة البطين ، وإخراجها مع المكبس في المتوسط الجليد الباردة (Fig.1). explants ثلاثة إلى أربعة من 0.5 ويمكن إجراء قطرها ملم من شركة جنرال الكتريك في احد P0 النمس شريحة الدماغ. يرجى ملاحظة أنه في كلتا القوارض وقوارض ، وتنصهر في GES الإنسي والجانبية في هذه المرحلة العمرية. إذا كان جوهر يبقى في شريحة أو عالق إلى أسفل البلاستيكية للطبق ، وحشد من قبل التدفق aCSF مع طرف ماصة ونقل مع ماصة في صحن يحتوي المتوسطة Neurobasal الباردة. الحفاظ على طبق على الجليد الرطب.
- نقل دفعة من explants من المتوسط إلى انخفاض عدد كبير من الجليد الباردة Matrigel (حوالي 0.25 - 0.5ml) وضعت في طبق منفصل ، مع الحرص على أن يكون explants مغمورة تماما وتجنب الفقاعات. الحفاظ على طبق على الجليد الرطب. حجم دفعة يعتمد على سرعة مجرى سير العمل.
3. الإعداد الثقافة (استخدام مجهر تشريح)
- دائما Matrigel وMatrigel المحتوية على الجليد يمزج لتجنب المعالجة.
- ريمكس تعليق حبة ومكان 1 - 2μl أو أقل من تعليق خرزة في الجليد الباردة Matrigel في وسط الزجاج توضع ساترة سابقا في لوحة الثقافة جيدا باستخدام تلميح 20μl ماصة. ندعه مجموعة قليلا ، وتجنب الجفاف.
- تلميح باستخدام ماصة 20μl التقاط explants 2 من القائمة المنسدلة Matrigel ووضعها في محيط المرجوة من ودائع حبة (على الأقل 1MM بعيدا عن حافة إيداع) بشكل متناظر على طرفي نقيض. السماح لها مجموعة لمدة لا تزيد 5min في درجة حرارة الغرفة ، والتوقيت المناسب من الخطوات ب و ج أمر بالغ الأهمية. إذا كان الوقت قصيرا جدا وسوف يؤدي ذلك إلى عدم اكتمال التبلور ومكونات الثقافة الإعداد سوف تتحرك عندما يتم تغطيتها بطبقة من Matrigel النهائي ، وإذا كان وقت طويل جدا قد يؤدي إلى جفاف أكثر من الجل وخلق الحواجز المادية التي تعيق حرية تنقل الخلايا.
- تغطية والخرز ويزدرع مع طبقة مسطحة من حوالي 30μl من Matrigel ، امتداده خارج explants (Fig.2). ندعه المنصوص عليها في الحاضنة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 2ml المتوسطة Neurobasal مع ملاحق.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ O 2 / 95 ٪ رصد النشاط 2 المهاجرة يوميا.
4. يعيش التصوير
- بعد حضانة لمدة 3-4 أيام ، واستعراض لوحات والثقافة ، واختيار coverslips المصالح. يجب أن تولد explants سحابة موحدة شعاعيا من الخلايا. استبدال coverslips المختار في لوحة الثقافة الجديدة التي سيتم استخدامها في تصوير حي.
- السماح للcoverslips الجلوس في لوحة جديدة خلال الليل. قبل ان يضع لوحة على المجهر للتصوير ، في خلية ثقافة هود ، واستخدام ملعقة لتحريك العقيمة ساترة من أجل الإفراج عن أي microbubbles التي تجمع بين لوحة ساترة والثقافة الخلية. وسوف تدخل فقاعات الخراب الصور. نقل coverslips إلى وسط البئر.
- لمنع التبخر ، وملء الفراغ بين الآبار بالماء.
- نقل بعناية لوحة من الخلية هود الثقافة المجهر حتى لا تحرك coverslips من وسط البئر.
- تعريف نظام التصوير باستخدام برامج التصوير ، ونظرا لطبيعة 3D الإعداد للثقافة أيضا نقل الخلايا عموديا ، وبالتالي فإنه من المهم جمع Z - الطائرات يشمل العمق الكامل للسحابة الهجرة. وينبغي أيضا مدى XY للمنطقة أن التقط مجموعة كبيرة بما يكفي لتغطية المناطق التي يتوقع أن يتم ملؤها من قبل الخلايا المهاجرة أثناء التسجيل ، ويحتوي على ودائع حبة من أجل تسجيل التوجه الزاوي لازدراع والخلايا المهاجرة مقارنة مصدر للبروتين. تنظر أيضا أنه كلما تصوير طائرات Z ، أو أكثر من المساحة التي تغطيها ، والمزيد من الوقت الذي يستغرقه لتسجيل حلقة في نقطة زمنية معينة ، مما اضطر فترات زمنية أطول بين العينات وفقدان القرار الزماني لتعقب الخلية. في حالتنا ، وذلك باستخدام الهدف 10X ، كان المخطط الأمثل لتسجيل بلاط 3X3 لكل من Z - 10 طائرات متباعدة كل 20μm ، على فترات 30min. وجدنا فترات أطول 30 دقيقة تسمح بتحديد لا لبس فيه من الخلايا في وقت نقاط متتالية ، وهو أمر حاسم لتتبع تحركاتهم موثوق بها.
- بدء تصوير مرور الوقت.
- بعد الوقت المطلوب ، وإزالة لوحة والإصلاح الثقافات في 4 ٪ الفوسفات مخزنة بارافورمالدهيد. يمكن استخدامه لمزيد من التحليل الصرفي وimmunocytochemical.
5. تحليل الحركة
- تحويل سلاسل زمنية من الصور المسجلة في شكل أكثر ملاءمة لمزيد من المعالجة ، TIFF ، كونها الأكثر المحمولة.
- تتبع حركة الخلايا الفردية على مر الزمن من خلال تسجيل إحداثيات XY ، ويمكن القيام بذلك باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية مثل ImageJ (NIH) مع تتبع المختصر في المكونات ، أو أي تطبيق تجارية أخرى مثل ImagePro ، أو Volicity AutoQuant.
- رسم المسارات باستخدام Excel أو في منزل البرمجيات المتقدمة.
- لكل خلية تتبع حساب المعلمات الحركية مثل متوسط السرعة ، انحناء المسار ، وتقلب الاتجاه مع مرور الوقت ، المتفرعة ، والانحراف في اتجاه مصدر للبروتينات ، ويمكن القيام به وما الحسابات في MS Excel أو أي جدول ما يعادلها. لكن خبرتنا تشير أنه أبعد ما يكون أكثر إنتاجية لتطوير البرامج النصية في المنزل (باستخدام R ، ماتلاب ، بيثون ، بيرل أو غيرها ، لغات المصدر المفتوح في الغالب) ، كما أنها تسمح للتخصيص أكثر مرونة وإدراج الطرق التحليلية أكثر تطورا من تلك التي تتوفر في تثبيت الأساسية من Excel.
6. ممثل النتائج :
الشكل 1. رسم تخطيطي للأوريجي التشريحيةن من explants. هذا هو رسم لشريحة من الدماغ الاكليلية النمس hemisected. الدوائر الرمادية تشير إلى المنطقة التي اتخذت explants.
الشكل 2. رسم توضيحي لإعداد الثقافة. إيداع حبة هو مصدر للبروتينات ، ويتم وضع explants إلى جانبي ، وتتم تغطية جميع العناصر مع Matrigel.
الشكل 3. المناظرة قطع المسارات الخلية الملونة التي الأرباع (السهام نحو نقطة إيداع حبة). المسارات الخلية على اليمين وتهاجر نحو مد الكسر ، والذي يظهر على جذب الخلايا ، والخلايا على اليسار وتهاجر نحو ألف جزء ، والذي يظهر في مقاومة الخلايا المهاجرة.
الشكل 4. أ) مجموعة من الصور المختارة من timepoints تظهر سحابة متزايدة من الخلايا المهاجرة من أصل ازدراع. يتم تعقب خلية سبيل المثال ، أشار إليه أحد الأسهم ، مع مرور الوقت كما هو مبين أدناه (شريط مقياس 200μm). وتصور هذه يزدرع مع التصوير لمدة 38 ساعة العيش الصور المعروضة هنا هي من الخلايا ترك يزدرع من بداية تسجيل الصور إلى الصورة النهائية. B) الخلية المشار إليها في الجزء ألف في الأوقات المحددة. الخلية يظهر المتفرعة المتكررة (مقياس شريط 50μm).
Discussion
هنا نقدم نظام بسيط لدراسة وتحليل السلوك المهاجرة من الخلايا العصبية في استجابة لاشارات كيميائية في المختبر فحوصات الهجرة استخدمت لتحديد الجزيئات التي تؤثر على تنقل خارج الخلية من الخلايا. لدينا نموذج يضمن أن كل خلية فردية درس لديه 3 الأبعاد (3D) مع البيئة التي تتفاعل. انها ميزة كبيرة على الثقافات حيث تهاجر خلايا من explants يضطر للتحرك على سطح مستو من بولي - D - يسين المغلفة ساترة ، وبالتالي يخلو من التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال هرشبيرغ آخرون '10؛ 8. ميتين وآخرون. '07). لكن فيما يتعلق على نطاق أوسع لتعقب الخلايا المهاجرة ، فإنه لا يزال 2 الأبعاد ، كما هي مقيدة رأسيا الخلايا إلى المسافة بين ساترة الزجاج على السطح السفلي والعلوي من Matrigel ، وهي رقيقة نسبيا بالمقارنة مع الحرية الأفقي للهجرة. مثل هذا الإعداد يسمح لتسهيل تحليل الحركة ، والذي لا يزال أساسا 2 الأبعاد. كانوا يعملون سابقا نماذج 3D مماثلة تتألف من explants GE - المجاميع أو إعادة الخلايا GE جزءا لا يتجزأ من الكولاجين أو Matrigel ، وذلك باستخدام خلايا من الركام تعبر عن بروتين معين يشير كمصدر للإشارات الكيميائية (مثل Liodis آخرون '07؛ مارتيني وآخرون . بن '09؛ نوبريجا ، وآخرون بيريرا'08 ؛ Wichterle آخرون '03). الطريقة المعروضة هنا يستخدم نظام الإفراج البطيء في شكل حبات اللثي مع بروتينات انضمت للسماح لمستوى مستدام في البيئة المحلية ، وهي نسبة أعلى من البروتينات وأضاف مباشرة إلى المتوسط ، مما يجعل نظام مناسب خصوصا عندما يتوفر مبلغ غير محدودة من البروتين ، أو عندما يتم اختبار خليط معقد من البروتينات. لا يقتصر اختيار حبات لمادة اللاتكس المنتجات القائمة ، ويشمل أيضا مواد أخرى ، على سبيل المثال agarose الخرز ، ولكل منها خصائص مختلفة. وذلك لزيادة كثافة مقايسة ، وتستخدم نحن اثنان explants apposed لإيداع الخرز على طرفي نقيض. لضمان وجود منطقة محددة من الأصل ، وقد استخدمنا explants البارزة العقدية كمصدر للخلايا. قمنا بتقييم الاختلافات في أجزاء الإنسي والجانبية للفضيلة العقدية ، ولكن لم ير أي خلافات. وينبغي أن نشير إلى أن هذه الدراسة يستخدم قوارض ، وفي هذه الأنواع البوارز الإنسي والجانبية العقدية الصمامات في وقت سابق من القوارض (Poluch آخرون '08). في الوقت الذي كان أدلى الثقافات (P0) كانت تنصهر في البوارز الإنسي والجانبية العقدية ، على الرغم من العديد من الخلايا لا تزال ملء المخية الحديثة التي يتم توليدها والمهاجرة. ومع ذلك ، إذا كان هو المفضل مصدر متجانسة حقا من الخلايا ، يمكن أن تكون على استعداد تعليق خلية من أنسجة تشريح والمختلط مباشرة مع Matrigel ، أو نسج أسفل بدلا من بيليه واللكم مما أدى إلى جعل 'explants. تم تخيف استخدام أنسجة الأنزيمية الهضم لإعداد التعليق الخلية ، بل بحثا عن آثار متبقية من نشاط بروتين يمكن تسييل Matrigel على مدار التجربة. أيضا ، وهو الحرص الواجب أن تطبق على توقيت الإعداد الثقافة. على الرغم من Matrigel يتطلب فترة من ارتفاع درجات الحرارة الى تتبلمر ، وحتى فترة ممتدة قليلا من التعرض لقطرات صغيرة من Matrigel (كما تستخدم في هذا البروتوكول) في الهواء يسبب التجفيف والنتائج في قذيفة التي لا يمكن اختراقها إلى الخلايا المهاجرة والتي لا يمكن محوها من من خلال تغطية لاحقة مع Matrigel الطازجة.
Disclosures
استخدام الحيوان : تم تنفيذ كافة الاجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا لمبادئ توجيهية USUHS والمعاهد الوطنية للصحة والمؤسسية التي وافقت عليها IACUC USUHS.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل وزارة الدفاع غرانت PT074620 (SLJ) وغرانت NIH R01NS245014 (SLJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
- Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice. Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).
- Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons. J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).
- Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia. Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).
- Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis. Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).
- Hatten, M. E. Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain. Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).
- Hatten, M. E. Central nervous system neuronal migration. Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).
- Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).
- Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development. Development. 134, 2815-2827 (2007).
- Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. , 136-1341 (2009).
- Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, 733-745 (2008).
- Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. New directions for neuronal migration. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).
- Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia. Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres. Biotechniques. 23, 928-937 (1997).
- Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).
