Summary
时间失效成像的三维组织培养研究，单个细胞对原产于大脑皮层反应蛋白提取物分割神经节隆起的迁徙行为。
Abstract
细胞迁移是一个共同的过程，导致脊椎动物的中枢神经系统的发展和成熟（阿唐，'99）。包括两个基本的神经类型：兴奋和抑制的大脑皮层。这些细胞出现在不同的地区，迁移到皮质，沿不同路线（ 珀尔曼等，'98） 。抑制interneurons迁移切线方向从皮质来源，大多来自不同区域的神经节金榜（Gelman 等 ，'09;徐等 ，'04）。。他们的运动，需要精确的时空控制，对环境线索，以便为建立适当的细胞结构和大脑皮层连接（Caviness Rakic，'78，阿唐，'90; Rakic，'90）。要学习的迁徙行为产生的细胞增殖区的神经节金榜公司（GE） 在体外新生雪貂，我们使用一个在BD基质胶基质的三维文化的安排。文化设置包括两个GE植和从大脑皮层中提取和定位之间的植（Hasling 等 ，'03，谜语等 ，'97）。荧光乳胶Retrobeads第九吸附测试蛋白质的来源。经过2-3天文化，细胞开始出现在边缘外植体，呈现出倾向留在径向方向的组织。实时成像允许迁徙模式的观察，没有标签或标记的细胞的必要性。当暴露等时深挖皮质中提取的蛋白质获得分数，GE细胞显示个别细胞的定量动力学分析判断，不同的行为。
Protocol
1。试剂准备
- 解冻冷冻基质胶，湿冰实验前（不加快积极变暖的过程中）留下足够的时间。基质胶是用来建立一个3D的环境极为相似利于细胞外基质细胞迁移。 它提供了与基板和机械包裹的细胞 。 基质胶是储存在-20 ° C冷冻在使用之前，它应该是逐渐长大的温度0-4 ° C，即在湿冰或在冰箱解冻。基质胶不可逆转的设置，形成凝胶在孵化温度（37℃）。因此，这是不建议加快解冻浸泡在温水中的容器 。
- 准备从产后当天0（P0），鼬的大脑皮层的总蛋白提取物等电聚焦（IEF）的蛋白质组分。分离后，分数是对20MM的Tris -盐酸PH7.2透析过夜清洁聚焦缓冲成分，这可能是有毒的组织中提取。
- 从大脑皮层中提取的蛋白质交付系统。蛋白质被吸附在荧光乳胶珠，然后慢慢释放的蛋白质environment.We发现，荧光功能有助于在微球的视觉处理，并允许从网站容易发现即使是最小的外溢珠存款时，荧光显微镜下观察。
- 添加荧光珠加入10μl的蛋白质溶液100 -200μL
- 在室温下孵育一个摇床在黑暗30分钟
- 最大速度为1小时的台式离心机旋转珠
- 去除上清液
- 重新暂停使用新鲜培养液中加入10μl的旋涡
- 暂停添加基质胶30μl，拌匀，置于冰上。
- 缓冲器和媒体
- 准备和过滤消毒人工脑脊液（ACSF 124毫米氯化钠，碳酸氢钠3 26MM的NaH 2 PO 4 1.2MM，3.2MM氯化钾，硫酸镁4 1.2MM， 氯化钙 2.4毫米，葡萄糖10MM）。搪塑冻结学联事前，所以准备在组织剥离时，为了使它充满无菌学联在-80 ° C冰箱，放置一个塑料瓶 。 监视器冻结每个所以很多时候，所以当了一层冰建立的内壁上，打破它，并与流体混合 。 重复，直到烧瓶中主要含有冰融雪。缓冲区准备这样不仅支持组织的生存，而且还将低温，比矮胖的冰块组织机械危害较小 。
- 准备Neurobasal培养基与N - 2和B - 27补充剂补充说，根据制造商的建议，以及1mg/100ml庆大霉素，2毫米L -谷氨酰胺和0.6％葡萄糖。通过0.22μm的膜过滤消毒。注意保暖，在37℃，直到使用C。
- 培养板
- 由点睛每口井用少量冷基质胶使用20μL枪头（约2μL），在它的中心，并把每下降一个蒸压一轮18毫米玻璃盖玻片的文化品位塑料六孔板准备。无论是板块，也不是盖玻片需要，否则文化对待。
2。组织编制
- 获得的脑组织
- 深深Euthasol动物麻醉后，取出大脑，并将其放置在冰冷的ACSF
- 单独用手术刀半球和切片冠在500微米，使用的首选设备，收集到一个小含有冰冷学联菜片
- 植（使用解剖显微镜）
- 识别片含有神经节金榜（GE）和皮质镶边地区可能会卷曲通过GE和干扰进一步的步骤
- 按哈里斯单核孔在该地区靠近心室表面的GE，主要是一个含有脑室区收回的核心，它驱逐到冰冷的介质（图1）柱塞三到四个0.5植毫米直径可以从GE在单P0深挖大脑切片。请注意，在老鼠和雪貂，融合在这个年龄段的内侧和外侧GES。如果一个核心的片或停留在被套牢的塑料盘底部，调动喷出学联与一个枪头，用移液器转移到包含冷Neurobasal培养基的菜 。 保持湿冰盘。
- 从中长期转移一批外植体放置在一个单独的盘的大幅回落到一个冰冷的基质胶（约0.250.5毫升），照顾有植完全沉浸和避免泡沫。保持湿冰盘。一个批次的大小取决于工作流程下游的速度。
3。文化设置（使用解剖显微镜）
- 始终保持基质胶和含冰基质胶混合，以避免固化。
- 混音珠悬挂和1 -2μL或珠悬浮在冰冷的基质胶在以前放置在培养板以及使用20μL吸管尖玻璃盖玻片中心的地方。让它一点点，避免干燥。
- 使用20μL枪头拿起基质胶下降2植珠存款附近（至少1毫米远离存款边缘）两侧对称。它设置为不超过5分钟，在室温。 适当时机的步骤B和C是关键。如果时间太短，它会导致不完整的胶凝和文化安装的组件将移动时，他们的最后一层基质胶覆盖，如果时间过长，可能会导致过度干燥的凝胶和创造物理屏障，阻碍细胞的自由流动。
- 与平层约30μl基质胶盖珠和外植体，超越植（图2）。让孵化器为约15分钟。
- 添加补充Neurobasal中等2毫升。
- 孵育37℃，5％的CO 2 / 95％的O 2每天监测候鸟活动。
4。实时成像
- 3-4天的潜伏期后，审查培养皿，并选择感兴趣的盖玻片。外植体，应该产生的细胞呈放射状均匀的云。更换到一个新的培养板将用于实时成像选择盖玻片。
- 让盖玻片在新盘在夜间坐在。放在显微镜成像板之前，在细胞培养罩，使用无菌压舌板移动盖玻片，以释放任何盖玻片和细胞培养板收集之间的微泡。气泡的干扰会毁了图像。将盖玻片以及中心。
- 为了防止蒸发，填补与水井之间的空间。
- 小心地转移板块从细胞培养罩显微镜不动以及中心的盖玻片。
- 定义成像计划，利用图像处理软件。 由于文化设置的3D性质的细胞也有垂直移动，因此重要的是收集Z型飞机，包括全面深入的迁移云。 成像面积的XY程度上也应设置足够大的预测是在录制过程中，细胞迁移，人口的地区和含珠的存款，以记录外植体细胞迁移的角度方向和相对的蛋白质来源。还可以考虑更多的成像z平面，或更多的面积覆盖，它需要更多的时间记录在一特定时点上一个周期，迫使细胞追踪的时间分辨率的损失和样品之间的间隔较长时间。 在我们的例子中，使用了10倍的目标，最优方案是一个Z型飞机每20微米，间隔为30分钟的间隔，每组10只的3x3瓦的记录。 我们发现，30分钟的间隔时间最长的，允许在连续的时间点，这是可靠跟踪他们的行踪的关键细胞的明确识别。
- 启动时间的推移成像。
- 所需的时间后，取出板和固定在4％的磷酸盐缓冲多聚甲醛的文化。它可用于进一步的形态学及免疫细胞化学分析。
5。运动分析
- 转换成的格式进行进一步的处理最方便，TIFF格式最便携的图像记录的时间序列。
- 跟踪单个细胞随着时间的推移，录音XY坐标的运动，这是可以做到像ImageJ（NIH）免费提供软件使用手动跟踪插件，如ImagePro，Volicity或AutoQuant或任何其他的商业应用。
- 使用Excel或内部开发的软件绘制的轨道。
- 每个跟踪的单元格计算动力学参数，如平均车速，路径的曲率，随着时间的推移定向变异，分支，走向的蛋白质来源偏差等计算，可以在MS Excel或任何同等的电子表格。 我们的经验表明，然而，这是得多生产力发展内部的脚本（使用R，MATLAB，使用Python，Perl或其他，大多是开源语言），因为他们比那些更灵活的个性化和更复杂的分析方法列入允许在安装的Excel的基本 。
6。代表性的成果：
图1。的解剖原稿图N外植体。这是一个绘制了一个hemisected揪出脑冠状切片。灰色圆圈表示的地区，采取从外植体。
图2图文化设置。珠存款的蛋白质来源;，外植体放置到任何一方的所有元素都与基质胶盖。
图3。通讯地块象限（箭头指向点珠存款）彩色细胞轨道。右边的单元格的曲目对分数D，这似乎吸引细胞迁移;左侧的细胞走向的一小部分，这似乎浅水湾细胞迁移的迁移。
图4。 A）系列呈现出越来越多的外植体迁移的细胞云从选定的时间点的图像。由箭头指示，例如细胞，是通过时间跟踪，如下所示（比例尺为200μm）。此外植体是38小时实时成像与可视化这里展示的是从开始录制的图像最终图像B）细胞中的一部分显示在次表示离开的外植体细胞的图像。该单元格显示重复的分支（比例尺为50μm）。
Discussion
在这里，我们提出了一个简单的系统研究和分析化学信号的神经细胞的迁徙行为。体外迁移实验已用于识别影响运动细胞的胞外分子。我们的范式，确保每一个人的细胞研究具有3维（3D）环境与互动。文化细胞外植体的迁移，这是一个相当大的优势，被迫D -聚赖氨酸包被的盖玻片平坦的表面上移动，从而泯灭的相互作用与细胞外基质（如希尔施贝格等人'10 ; 8。倚天等。'07）。然而，跟踪细胞迁移的规模较大，它仍然二维，细胞水平的自由相比，在底部的玻璃盖玻片和基质胶，这是比较薄的顶面之间的空间垂直约束迁移。这样的设置可以容易的运动分析，仍然基本上是2维。以前类似的3D范例组成的GE植或嵌入在胶原或基质胶GE细胞重新聚集，就业，利用细胞的聚集，表达一个特定的信号蛋白作为一种化学信号源（ 如Liodis等人'07; Martini等人'09。Nóbrega -佩雷拉等 '08; Wichterle 等'03）。坚持蛋白乳胶珠的形式，这里介绍的方法使用一个缓慢释放系统，以便在当地环境的持续的水平，这是比蛋白质直接添加到中期，使系统特别适合时可用金额蛋白质是有限的或复杂的蛋白质混合物进行测试时。珠的选择是有限的，以乳胶为基础的产品，包括其他材料，例如琼脂糖珠，各有不同的特点。为了进一步提高检测的密度，我们使用两个植apposed两侧的珠存款。要确保原产地的具体面积，我们作为一个细胞来源的神经节隆起植。我们评估了在内侧和外侧的神经节隆起部分的差异，但没有看到任何的差异。我们应该指出，这项研究使用的雪貂，在这个物种的内侧和外侧的神经节金榜保险丝比早些时候在啮齿类动物中（Poluch等'08） 。在文化作了时间（P0）的内侧和外侧的神经节金榜融合，即使许多填充大脑皮层的细胞仍在生成和迁移。但是，如果真正的同质源是首选的细胞，细胞悬液，可以从解剖组织编制，并直接与基质胶混合，或者降速，并产生沉淀打了个“植”。组织消化酶的使用，准备细胞悬液气馁，甚至残留的蛋白水解酶活性，可以在实验过程中液化基质胶。此外，尽职调查已经被应用到文化设置的时间。虽然基质胶需要一段时间的升温，以聚合，甚至一个暴露的基质胶小滴（在本议定书中所用的）的空气会导致干燥和一个，是坚不可摧的细胞迁移和它可以不被擦除的shell的结果略有延长期随后用新鲜的基质胶覆盖。
Disclosures
动物使用：所有涉及动物的程序，按照USUHS和美国国立卫生研究院的体制指引USUHS IACUC批准。
Acknowledgments
这项工作是由国防部批准PT074620（SLJ）和美国国立卫生研究院资助R01NS245014（SLJ）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
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