Summary
Time lapse beeldvorming van 3D-weefselkweek maakt het bestuderen van trekgedrag van de individuele cellen die afkomstig zijn van ganglion eminentie in reactie op gefractioneerde eiwitten halen uit cerebrale cortex.
Abstract
Migratie van cellen is een gemeenschappelijk proces dat leidt tot de ontwikkeling en rijping van de gewervelde centrale zenuwstelsel (Hatten, '99). De cerebrale cortex bestaat uit twee fundamentele neuronale types: prikkelende en remmende. Deze cellen ontstaan in verschillende gebieden en migreren naar de cortex langs verschillende routes (Pearlman et al.., '98). Remmende interneuronen migreren tangentiaal uit subcorticale bronnen, voornamelijk uit verschillende regio's van het ganglion eminenties (Gelman et al., '09;. Xu et al., '04.). Hun beweging vereist een nauwkeurige controle spatiotemporele opgelegd door omgevingsfactoren, zodat voor de oprichting van de juiste cytoarchitecture en connectiviteit in de cerebrale cortex (Caviness & Rakic, '78, Hatten, '90, Rakic, '90). De studie van de trekgedrag van cellen gegenereerd in proliferatieve zones van de ganglion eminenties (GE) bij pasgeboren fretten in vitro hebben we gebruik gemaakt van een 3-dimensionale cultuur arrangement in een BD Matrigel Matrix. De cultuur setup bestond uit twee GE explantaten en een bron van geteste eiwitten uit de cerebrale cortex en geadsorbeerd aan fluorescerende latex Retrobeads IX gepositioneerd tussen de explantaten (Hasling et al., '03;. Riddle et al., '97.). Na 2-3 dagen van de cultuur, de cellen beginnen te verschijnen aan de rand van de explantatie met een neiging om het weefsel te verlaten in een radiale richting. Live-imaging toegestaan observatie van migratiepatronen, zonder de noodzaak van etikettering of markering van de cellen. Bij blootstelling aan fracties van het eiwit extract verkregen uit isochronic fret cortex, de GE-cellen weergegeven verschillende gedragingen zoals beoordeeld door kwantitatieve kinetische analyse van individuele bewegende cellen.
Protocol
1. Bereiding van het reagens
- Ontdooi ingevroren Matrigel op nat ijs, waardoor er genoeg tijd voor het experiment (niet het proces te versnellen door actief de aarde). Matrigel wordt gebruikt om een 3D-omgeving sterk gelijkende een extracellulaire matrix bevorderlijk zijn voor de migratie van cellen vast te stellen. Het biedt cellen met zowel een substraat en mechanische omkasting. Matrigel is bevroren opgeslagen bij -20 ° C. Voorafgaand aan de gebruiken, het moet geleidelijk worden aangepast aan de temperatuur van 0-4 ° C, dat wil zeggen ontdooide op natte ijs of in de koelkast. Matrigel sets onomkeerbaar het vormen van een gel in de temperatuur van de incubatie (37 ° C). Daarom is het niet aan te raden te versnellen ontdooien door onderdompeling van de container in warm water.
- Eiwitfracties worden bereid door iso-elektrische focussering (IEF) van de totale hoeveelheid eiwit uittreksel uit de cerebrale cortex van postnatale dag 0 (P0) fret. Na de scheiding zijn de fracties 's nachts gedialyseerd tegen 20 mm Tris-HCl pH7.2 om de uittreksels reinigen van de focus buffer bestanddelen, die zouden kunnen worden toxisch zijn voor het weefsel.
- Eiwitten leveren systeem. Eiwitten uit de cerebrale cortex worden geadsorbeerd op fluorescerend latex kralen die langzaam vervolgens de eiwitten vrij te geven aan de environment.We vastgesteld dat de fluorescentie functie helpt in de visuele verwerking van microsferen en maakt eenvoudige detectie van zelfs een minimale spillovers van de plaats van kraal storting, wanneer waargenomen onder fluorescentiemicroscoop.
- Voeg 10μl van fluorescente beads tot 100-200μl van de eiwitoplossing
- Incubeer 30min in donkere bij RT op een shaker
- Spin de kralen in een bench centrifuge voor 1 uur bij max. snelheid
- Verwijder supernatant
- Re-schorten in een draaikolk met 10μl van vers medium
- Voeg 30μl van Matrigel aan de suspensie, goed mengen, en leg ze op ijs.
- Buffers en media
- Voor te bereiden en filtratie-steriliseren artificiële hersenvocht (aCSF, NaCl 124mM, NaHCO 3 26mm, NaH 2 PO 4 1.2mm, 3.2mm KCl, MgSO 4 1.2mm, CaCl 2 2,4 mm, Glucose 10 mm). Slush-vries de aCSF op voorhand, zodat het klaar is op het moment van weefsel dissectie. Om het, plaatst u een plastic fles gevuld met steriele aCSF in een -80 ° C vriezer. Monitor invriezen om zo vaak, dus als een laagje ijs bouwt aan de binnenkant van de muur, breken en mengen met de vloeistof. Herhaal dit totdat de fles bevat meestal een ijzige slush. Buffer voorbereid op deze manier ondersteunt niet alleen weefsel overleven, maar zal ook houden lage temperatuur langer, en is mechanisch minder schadelijk voor het weefsel dan stevige ijsblokjes.
- Bereid Neurobasal medium met N-2 en B-27 supplementen toegevoegd volgens de fabrikant suggesties, evenals 1mg/100ml gentamycine, 2 mM L-glutamine, en 0,6% glucose. Steriliseer door filtratie door een 0.22μm membraan. Houd warm bij 37 ° C tot gebruik.
- Kweekplaten
- Cultuur grade plastic zes-well platen zijn voorbereid door puntjes op elk putje in het midden met een kleine hoeveelheid (ongeveer 2μl) koud Matrigel gebruik van 20μl pipetpunt, en het plaatsen van een geautoclaveerd ronde 18mm glas dekglaasje op elke druppel. Noch de platen, noch de dekglaasjes moeten worden anders is de cultuur behandeld.
2. Tissue voorbereiding
- Het verkrijgen van het hersenweefsel
- Na diep verlamming het dier met Euthasol, verwijder de hersenen en plaats deze in ijskoud aCSF
- Scheid de hemisferen met een scalpel en snijd coronaalwaarts op 500μm met behulp van een apparaat van keuze, het verzamelen van plakken in een kleine schotel met ijskoud aCSF
- Maken explantaten (gebruik dissectiemicroscoop)
- Identificeer plakjes met het ganglionisch eminenties (GE) en knip de regio's van de cortex die krullen dan GE en interfereren met de verdere stappen
- Druk op een Harris Uni-Core boring in het gebied dicht bij ventriculaire oppervlakte van GE, trekken een kern met hoofdzakelijk een ventriculaire zone en verdrijven hem met een zuiger in het ijs-koude medium (Fig.1). Drie tot vier explanten van 0,5 mm diameter kan worden gemaakt van de GE in enkele P0 fret hersenen slice. Houdt u er rekening mee dat bij zowel knaagdieren en fretten, de mediale en laterale GEs zijn gefuseerd op deze leeftijd. Als een kern blijft in de slice of zit vast aan het plastic bodem van de schaal, te mobiliseren door spuiten aCSF met een pipet en breng met een pipet in het schaaltje met koude Neurobasal medium. Hou de schotel op nat ijs.
- Overdracht van een partij van explantaten van het medium in een grote druppel ijskoude Matrigel (ongeveer 0,25 0,5 ml) geplaatst in een apart schaaltje en zorg ervoor dat de explantaten volledig ondergedompeld en het vermijden van bubbels. Hou de schotel op nat ijs. De grootte van een partij afhankelijk van de snelheid van de workflow stroomafwaarts.
3. Cultuur setup (gebruik dissectiemicroscoop)
- Altijd Matrigel en Matrigel-bevattende mixen op het ijs tot het genezen te voorkomen.
- Remix de kraal schorsing en een plaats-2μl of minder van de kraal suspensie in ijskoude Matrigel in het midden van een glazen dekglaasje eerder geplaatst in een petrischaal goed af met een 20μl pipetpunt. Laat het set een beetje voorkomen dat ze uitdrogen.
- Met behulp van een 20μl pipettip pick-up 2 explantaten van de Matrigel te laten vallen en plaats ze in de gewenste nabijheid van de kraal aanbetaling (minstens 1 mm afstand van de rand van de borg) symmetrisch op de tegenoverliggende zijden. Laat het voor niet langer dan 5 minuten bij kamertemperatuur. De juiste timing van de stappen b en c is van cruciaal belang. Als de tijd is te kort zal leiden tot onvolledige gelering en onderdelen van de cultuur setup zal bewegen wanneer ze worden bedekt met de laatste laag van de Matrigel, als het te lang is, resulteert dit in over-drogen van de gel en de creatie van fysieke barrières belemmeren het vrije verkeer van cellen.
- Bedek de kralen en de explantatie met een platte laag van ongeveer 30μl van Matrigel, uit te breiden buiten de explantaten (Fig.2). Laat het in de incubator voor ongeveer 15 minuten.
- Voeg 2 ml van Neurobasal medium met supplementen.
- Incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2 / 95% O 2 monitoren trekkende activiteit per dag.
4. Live-imaging
- Na incubatie gedurende 3-4 dagen, herziening van de cultuur platen en kies dekglaasjes van belang. De explantaten zou moeten leiden tot een radiaal uniform wolk van cellen. Vervang de gekozen coverslips in een frisse cultuur plaat die zullen worden gebruikt in live beeldvorming.
- Laat de dekglaasjes zitten in de nieuwe plaat 's nachts. Voor het plaatsen van de plaat op de microscoop voor beeldvorming, in een cel cultuur kap, een steriele spatel om de dekglaasje bewegen om alle microbellen dat verzamelen tussen het dekglaasje en de celkweek plaat release. Interferentie van belletjes zal ruïneren de beelden. Verplaats de dekglaasjes naar het midden van de put.
- Om te voorkomen dat verdamping, vul de ruimte tussen de putten met water.
- Breng voorzichtig de plaat uit de celkweek kap aan de microscoop om niet de dekglaasjes verplaatsen van het midden van de put.
- Definieer een imaging systeem met behulp van imaging-software. Door de 3D-karakter van de cultuur het instellen van de cellen ook verticaal te verplaatsen, daarom is het belangrijk om Z-vliegtuigen te verzamelen omvat volledige diepte van de migratie wolk. De XY omvang van de belichte gebied moet ook worden ingesteld groot genoeg om gebieden zal naar verwachting worden bevolkt door migrerende cellen in de loop van de opname, te dekken en de hiel depot bevat om een hoekige oriëntatie van de Explantatie en migrerende cellen te nemen ten opzichte van de bron van het eiwit. Bedenk ook dat het meer afgebeeld Z vliegtuigen, of het gebied dat onder meer, des te meer tijd het kost om een fiets te nemen op een bepaald tijdstip, waardoor langere intervallen tussen de monsters en een verlies van temporele resolutie van cel tracking. In ons geval, met behulp van een 10x doelstelling, de optimale regeling was een 3x3 tegel opname voor elk van de 10 Z-vliegtuigen uit elkaar elke 20μm, met tussenpozen van 30 minuten. We vonden 30 min. intervallen de langste die ondubbelzinnige identificatie van cellen kunnen ten keer op rij punten, die cruciaal is voor een betrouwbare volgen van hun bewegingen.
- Initiëren time lapse imaging.
- Nadat de gewenste tijd, verwijder de plaat en bevestig culturen in 4% fosfaat-gebufferde paraformaldehyde. Het kan worden gebruikt voor verdere morfologische en immunocytochemische analyse.
5. Analyse van de beweging
- Zet de geregistreerde tijdreeksen van beelden naar een formaat het meest geschikt voor verdere verwerking, TIFF zijnde de meest draagbare een.
- De verplaatsing van individuele cellen na verloop van tijd door het opnemen van XY-coördinaten. Dit kan worden gedaan met behulp van vrij beschikbare software zoals ImageJ (NIH), met een handmatige Tracking plug-in, of enige andere commerciële toepassingen, zoals ImagePro, Volicity of AutoQuant.
- Plot de sporen met behulp van Excel of in eigen beheer ontwikkelde software.
- Voor elke cel gevolgd kinetische parameters zoals gemiddelde snelheid, de kromming van het pad, richting de variabiliteit in de tijd, vertakking, afwijking in de richting van de bron van eiwitten te berekenen, etc. De berekeningen worden gedaan in MS Excel of een gelijkwaardige spreadsheet. Onze ervaring geeft echter aan dat het veel productiever om te in-house scripts (met behulp van R, Matlab, Python, Perl of andere, meestal Open Source talen) te ontwikkelen, omdat ze zorgen voor meer flexibele maatwerk en integratie van meer verfijnde analytische methoden dan die verkrijgbaar in een basisinstallatie van Excel.
6. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Schema van de anatomische oorn van explantaten. Dit is een tekening van een coronale deel van een hemisected fret hersenen. De grijze cirkels geven de regio waar de explantaten werden genomen.
Figuur 2. Diagram van een cultuur setup. De kraal borg is de bron van eiwitten, de explantaten worden geplaatst aan beide zijden en alle elementen zijn bedekt met Matrigel.
Figuur 3. Overeenkomstige percelen van cel tracks gekleurd door kwadranten (pijlen wijzen in de richting van de kraal borg). De cel nummers op rechts zijn migreren in de richting van fractie D, die lijkt aan te trekken cellen, de cellen aan de linkerkant zijn migreren in de richting van fractie A, die lijkt te verdrijven migrerende cellen.
Figuur 4. A) Een reeks beelden van geselecteerde tijdstippen waarop een groeiende wolk van cellen uit een explantatie migreren. Een voorbeeld cel, aangegeven door een pijl, wordt bijgehouden door de tijd, zoals hieronder aangegeven (schaal bar 200μm). Dit explant werd gevisualiseerd met live imaging voor 38 uur Hier ziet u beelden van de cellen het verlaten van de explantatie vanaf het begin van het opnemen van de beelden naar het uiteindelijke beeld. B) De cel die in deel A op de aangegeven tijden. De cel toont repetitieve vertakking (schaal bar 50μm).
Discussion
Hier presenteren we een eenvoudig systeem te bestuderen en migratie het gedrag van neurale cellen te analyseren in reactie op chemische signalen. In vitro migratie testen zijn gebruikt om de extracellulaire moleculen die de voortbeweging van de cellen te identificeren. Ons paradigma zorgt ervoor dat elke onderzochte individuele cel een 3-dimensionaal (3D) omgeving waarmee interactie heeft. Het is een groot voordeel ten opzichte van culturen waar de cellen uit migreren van explantaten worden gedwongen te verhuizen op het vlakke oppervlak van poly-D-lysine-gecoate dekglaasje, dus verstoken van interacties met de extracellulaire matrix (bv. Hirschberg et al., '10;. 8. Metin et al.. '07). Maar met betrekking tot de grotere schaal van het bijhouden van migrerende cellen, blijft het 2-dimensionaal, omdat de cellen verticaal beperkt tot de ruimte tussen het glas dekglaasje op de bodem en de bovenkant van Matrigel, dat is relatief dun in vergelijking met de horizontale vrijheid van migratie. Een dergelijke setup zorgt voor een eenvoudigere analyse van beweging, die nog steeds in wezen twee-dimensionaal. Vergelijkbare 3D-paradigma's, bestaande uit GE explantaten of re-aggregaten van GE cellen ingebed in collageen of Matrigel, voorheen in dienst, met behulp van aggregaten van de cellen die een bepaald eiwit signalering als een bron van chemische signalen (bijv. Liodis et al., '07;. Martini et .. al. '09;. Nobrega-Pereira et al., '08; Wichterle et al. '03).. De methode die hier wordt gepresenteerd maakt gebruik van een vertraagde afgifte systeem in de vorm van een latex kralen met gehandeld eiwitten zorgen voor een constant hoog niveau in de plaatselijke omgeving, die hoger is dan eiwitten direct toegevoegd aan het medium, waardoor het systeem uitermate geschikt wanneer het bedrag van de beschikbare eiwit is beperkt of wanneer een complex mengsel van eiwitten is getest. De keuze van kralen is niet beperkt tot latex-gebaseerde producten, en omvat ook andere materialen, bijvoorbeeld agarose parels, elk met verschillende eigenschappen. Verder te verhogen de dichtheid van de test gebruikten we twee explantaten apposed om de kralen storten tegenover elkaar staan. Om ervoor te zorgen een bepaald gebied van herkomst, hebben we gebruik gemaakt ganglion eminentie explantaten als een bron van cellen. Evalueerden we verschillen in de mediale en laterale delen van het ganglion eminentie, maar zag geen verschillen. We moeten erop wijzen dat dit onderzoek fretten gebruikt; in deze soort de mediale en laterale ganglion eminenties eerder zekering dan in knaagdieren (Poluch et al., '08.). Op het moment dat de culturen werden gemaakt (P0) de mediale en laterale ganglion eminenties werden gefuseerd, ook al zijn veel cellen vullen de neocortex nog steeds worden gegenereerd en migratie. Echter, als een echt homogeen bron van cellen heeft de voorkeur, kan een celsuspensie worden bereid uit het weefsel ontleed en direct gemengd met de Matrigel, of als alternatief gesponnen naar beneden en een resulterende pellet geponst om 'explantaten' te maken. Het gebruik van enzymatische vertering weefsel naar de cel suspensie te bereiden wordt afgeraden, want zelfs sporen van proteolytische activiteit kan Matrigel vloeibaar te maken in de loop van het experiment. Ook een due diligence moet worden toegepast op de timing van de cultuur setup. Hoewel Matrigel vergt een periode van opwarming te polymeriseren, zelfs een iets langere periode van blootstelling van kleine druppels Matrigel (zoals gebruikt in dit protocol) om de lucht oorzaken drogen en resulteert in een shell die ondoordringbaar is voor migrerende cellen en die niet kunnen worden gewist door latere afdekken met verse Matrigel.
Disclosures
Gebruik van dieren: Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de USUHS en NIH institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de USUHS IACUC.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door DoD Grant PT074620 (SLJ) en NIH Grant R01NS245014 (SLJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
- Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice. Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).
- Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons. J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).
- Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia. Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).
- Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis. Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).
- Hatten, M. E. Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain. Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).
- Hatten, M. E. Central nervous system neuronal migration. Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).
- Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).
- Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development. Development. 134, 2815-2827 (2007).
- Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. , 136-1341 (2009).
- Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, 733-745 (2008).
- Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. New directions for neuronal migration. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).
- Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia. Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres. Biotechniques. 23, 928-937 (1997).
- Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).
