Summary
Imagerie laps de temps de culture de tissu en 3D permet d'étudier le comportement migratoire des cellules individuelles en provenance éminence ganglionnaire en réaction à extraire la protéine fractionnée à partir du cortex cérébral.
Abstract
La migration des cellules est un processus commun qui conduit à l'élaboration et la maturation du système nerveux des vertébrés centrale (Hatten, 99). Le cortex cérébral est constitué de deux types de base neuronale: excitateurs et inhibiteurs. Ces cellules se posent dans des domaines distincts et migrent dans le cortex le long des itinéraires différents (Pearlman et al., '98). Interneurones inhibiteurs migrer tangentiellement à partir de sources sous-corticales, la plupart provenant de différentes régions du éminences ganglionnaires (Gelman et al, '09;. Xu et al, '04.). Leur déplacement nécessite un contrôle précis spatiotemporelles imposées par des signaux environnementaux, afin de permettre l'établissement de cytoarchitecture correcte et la connectivité du cortex cérébral (Caviness & Rakic, '78; Hatten, '90; Rakic, '90). Pour étudier le comportement migratoire des cellules générées dans les zones de prolifération des éminences ganglionnaires (GE) chez les furets nés in vitro, nous avons utilisé un arrangement trois dimensions de la culture dans une matrice BD Matrigel. La configuration de la culture se composait d'explants GE deux et une source de protéines testées extraites du cortex cérébral et adsorbé sur fluorescente IX en latex Retrobeads positionné entre les explants (Hasling et al, '03;. Riddle et al, 97.). Après 2-3 jours de culture, les cellules commencent à apparaître au bord de l'explant montrant une propension à laisser le tissu dans une direction radiale. En direct d'imagerie a permis l'observation des mouvements migratoires sans la nécessité d'un étiquetage ou le marquage des cellules. Lorsqu'ils sont exposés à des fractions de la protéine extrait obtenu à partir du cortex furet isochrones, les cellules GE affiché des comportements différents à en juger par l'analyse cinétique quantitative des cellules individuelles en mouvement.
Protocol
1. Préparation des réactifs
- Décongeler Matrigel sur la glace mouillée, laissant suffisamment de temps avant l'expérience (ne pas accélérer le processus par le réchauffement actif). Matrigel est utilisé pour établir un environnement 3D ressemblant étroitement à une matrice extracellulaire propice à la migration des cellules. Elle fournit aux cellules à la fois avec un substrat et mécaniques enveloppe. Matrigel est congelée à -20 ° C. Avant utilisation, il devrait être progressivement porté à la température de 0-4 ° C, c'est à dire décongelées sur glace humide ou dans un réfrigérateur. Matrigel fixe irréversiblement pour former un gel de la température d'incubation (37 ° C). Par conséquent, il n'est pas recommandé d'accélérer le dégel en immergeant le récipient dans l'eau chaude.
- Les fractions protéiques sont préparés par focalisation isoélectrique (IEF) de l'extrait de protéines totales dans le cortex cérébral du jour postnatal 0 (P0) furet. Après séparation, les fractions sont dialysées pendant une nuit contre 20 mM Tris-HCl pH 7,2 à nettoyer les extraits à partir des constituants du tampon concentrant, qui pourraient être toxiques pour les tissus.
- Système de prestation des protéines. Protéines extraites du cortex cérébral sont adsorbées sur des billes de latex fluorescentes qui puis relâchez lentement les protéines à l'environment.We constaté que la caractéristique de fluorescence aide dans le traitement visuel de microsphères et permet une détection facile des retombées, même minime sur le site de perles de dépôt, lorsqu'ils sont observés sous microscope à fluorescence.
- Ajouter 10 ul de billes fluorescentes de 100 200 pl-de solution de protéine
- Incuber pendant 30min dans le noir à température ambiante sur un agitateur
- Faites tourner les perles dans une centrifugeuse pendant 1 heure à la vitesse maximale
- Retirer le surnageant
- Re-suspendre dans un tourbillon à l'aide 10 ul de milieu frais
- Ajouter 30μl de Matrigel à la suspension, bien mélanger, et placer sur la glace.
- Tampons et les médias
- Préparer et stériliser la filtration liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF; NaCl 124mm, 26mm de NaHCO 3, NaH 2 PO 4 1,2, KCl 3,2, 1,2 MgSO 4, CaCl 2 2,4, glucose 10 mM). Slush-geler les aCSF avance, afin qu'il soit prêt au moment de la dissection des tissus. Pour le faire, placez un flacon en plastique rempli de aCSF stérile dans un congélateur à -80 ° C. Moniteur de congélation chaque tellement souvent, alors quand une couche de glace s'accumule sur l'intérieur du mur, le casser et mélanger avec le liquide. Répétez jusqu'à ce que le flacon contient surtout une slush glacée. Tampon préparés de cette façon ne soutient pas seulement la survie des tissus, mais tiendra également à basse température plus longtemps, et est mécaniquement moins nocifs pour les tissus que les cubes de glace Chunky.
- Préparer milieu Neurobasal avec N-2 et B-27 suppléments ajoutés selon les suggestions du fabricant, ainsi que 1mg/100ml gentamycine, 2 mM de L-glutamine et du glucose à 0,6%. Stériliser par filtration à travers une membrane 0.22μm. Garder au chaud à 37 ° C jusqu'à utilisation.
- Les plaques de culture
- Culture plastique de qualité à six puits des plaques sont préparées par parsèment chaque puits en son centre avec une petite quantité (environ 2μl) de Matrigel froid en utilisant 20 pi pointe de la pipette, et en plaçant une lamelle autoclavé rond en verre 18mm sur chaque goutte. Ni les plaques, ni les lamelles doivent en être autrement de la culture traitée.
2. Préparation des tissus
- Obtention du tissu cérébral
- Après profondément anesthésier l'animal avec Euthasol, enlever le cerveau et le placer dans la glace froide aCSF
- Séparez les hémisphères avec un scalpel et tranche coronaire à 500 um en utilisant un dispositif de choix, la collecte des tranches dans un plat contenant de petites glacée aCSF
- Faire explants (utilisation loupe binoculaire)
- Identifier les tranches contenant les éminences ganglionnaires (GE) et les régions d'assiette de cortex qui peuvent se recourber sur GE et interférer avec d'autres mesures
- Appuyez sur une Harris Uni-carottage dans la zone proche de la surface ventriculaire du GE, rétracter un noyau contenant essentiellement une zone ventriculaire, et l'expulser avec un piston dans le milieu glacée (Fig.1). Trois à quatre explants de 0,5 mm de diamètre peuvent être fabriqués à partir de la GE en simple P0 tranche de cerveau chez le furet. S'il vous plaît noter que chez les rongeurs et les furets, le GES médial et latéral sont fusionnés à cet âge. Si un noyau reste dans la tranche ou est collé au fond du plat en plastique, la mobiliser en injectant aCSF avec une pointe de pipette et transférer à la pipette dans le plat contenant froide milieu Neurobasal. Gardez le plat sur la glace mouillée.
- Transfert d'un lot d'explants à partir du milieu dans une grosse goutte d'glacée Matrigel (environ 0,25 0.5ml) placée dans un plat à part, en prenant soin d'avoir les explants entièrement immergé et en évitant les bulles. Gardez le plat sur la glace mouillée. La taille d'un lot dépend de la vitesse de l'aval de workflow.
3. Configuration de la culture (utilisation loupe binoculaire)
- Toujours garder Matrigel et Matrigel contenant des mélanges sur la glace pour éviter de guérir.
- Remix de la suspension de billes et placer 1-2μl ou moins de la suspension de billes de glace froide Matrigel dans le centre d'une lamelle de verre préalablement placé dans une plaque de culture ainsi l'aide d'une pipette 20 pi. Laissez-le mettre un peu, éviter le dessèchement.
- En utilisant une pointe de pipette 20 pi relever 2 explants de la chute de Matrigel et les placer dans le voisinage du dépôt désiré perles (au moins 1 mm du bord du dépôt) symétriquement sur les côtés opposés. Laissez fixé pour pas plus de 5min à température ambiante. Le bon timing des étapes b et c est critique. Si le temps est trop court, il conduira à une gélification incomplète et les composants de l'installation de la culture va se déplacer quand ils sont recouverts de la couche finale de Matrigel; si le temps est trop long, il peut entraîner des sur-séchage du gel et la création de obstacles physiques entravant la libre circulation des cellules.
- Couvrir les perles et l'explant avec une couche plane d'environ 30μl de Matrigel, en l'étendant au-delà des explants (Fig.2). Laissez-le mettre dans l'incubateur pendant 15 minutes environ.
- Ajouter 2 ml de milieu Neurobasal avec des suppléments.
- Incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 / 95% O 2 activité de surveillance migrateurs quotidienne.
4. En direct d'imagerie
- Après une incubation de 3-4 jours, examiner les boîtes de culture et de choisir des lamelles d'intérêt. Les explants devrait générer un nuage radial uniforme de cellules. Remplacer lamelles choisie dans une plaque de culture frais qui seront utilisées dans l'imagerie en direct.
- Laissez-les lamelles s'asseoir dans la nouvelle plaque pendant la nuit. Avant de placer la plaque sur le microscope pour l'imagerie, dans une hotte de culture cellulaire, l'utilisation d'une spatule stérile pour déplacer la lamelle afin de libérer toute microbulles qui recueillent entre la lamelle et la plaque de culture cellulaire. Interférence des bulles va ruiner les images. Déplacer les lamelles au centre du puits.
- Pour éviter l'évaporation, de remplir l'espace entre les puits avec de l'eau.
- Soigneusement transfert de la plaque de la hotte de culture de cellules au microscope pour ne pas déplacer les lamelles du centre du puits.
- Définir un programme d'imagerie utilisant des logiciels d'imagerie. Raison de la nature 3D de l'installation de la culture des cellules aussi se déplacer verticalement, il est donc important de recueillir des Z-plans englobant toute la profondeur du nuage de la migration. La mesure XY de la zone imagée doit également être fixée assez large pour couvrir les zones prédit à être peuplée par des cellules migrent au cours de l'enregistrement, et de contenir le dépôt billes afin d'enregistrer une orientation angulaire de l'explant et les cellules migrent par rapport à la source de la protéine. Considèrent également que les avions plus imagée Z, ou la plus grande surface couverte, plus le temps qu'il faut pour enregistrer un cycle à un point de moment particulier, forçant des intervalles plus longs entre les échantillons et une perte de résolution temporelle de suivi cellulaire. Dans notre cas, en utilisant un objectif 10x, le schéma optimal est un enregistrement de carreaux de 3x3 pour chacun des 10 avions-Z espacés de 20μm, à des intervalles de 30 minutes. Nous avons trouvé des intervalles de 30 min le plus long qui permet d'identifier sans équivoque des cellules à des moments consécutifs, ce qui est essentiel pour un suivi fiable de leurs mouvements.
- Initier imagerie laps de temps.
- Après le temps désiré, retirer la plaque et de fixer les cultures dans 4% tamponné au phosphate paraformaldéhyde. Il peut être utilisé pour d'autres analyses morphologiques et immunocytochimiques.
5. Analyse du mouvement
- Convertir les séries chronologiques enregistrées des images dans un format plus pratique pour un traitement ultérieur, TIFF étant la plus portable.
- Suivre le mouvement des cellules individuelles au cours du temps par des coordonnées XY enregistrement. Cela peut être fait en utilisant le logiciel librement disponible comme ImageJ (NIH), avec un suivi manuel plug-in, ou toute autre application commerciale comme la ImagePro, Volicity ou AutoQuant.
- Tracer les pistes en utilisant Excel ou un logiciel maison développé.
- Pour chaque cellule suivis de calculer les paramètres cinétiques tels que la vitesse moyenne, la courbure de la trajectoire, la variabilité directionnelle au fil du temps, de branchement, la déviation vers la source de protéines, de calculs etc peut être fait dans MS Excel ou n'importe quel tableur équivalent. Notre expérience indique cependant qu'il est beaucoup plus productif de développer en interne des scripts (en utilisant R, Matlab, Python, Perl ou autres, les langues source essentiellement Open), car ils permettent une personnalisation plus souple et l'inclusion de plus de méthodes analytiques sophistiquées que celles disponibles dans une installation de base d'Excel.
6. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Schéma de l'anatomie orin des explants. C'est un dessin d'une tranche coronale du cerveau furet hemisected. Les cercles gris indiquent la région à partir de laquelle les explants ont été prises.
Figure 2. Schéma d'une installation de culture. Le dépôt perle est la source de protéines; les explants sont placées de chaque côté et tous les éléments sont recouverts de Matrigel.
Figure 3. Parcelles correspondant de pistes de cellules colorées par quadrants (flèches pointent vers le dépôt de billes). Les pistes de cellule sur la droite sont migrent vers la fraction D, qui semble attirer les cellules, les cellules sur la gauche sont la migration vers la fraction A, qui semble repousser les cellules migrantes.
Figure 4. A) Une série d'images à partir timepoints sélectionnés montrant un nuage de plus en plus de cellules en migration à partir d'un explant. Une cellule, par exemple, indiqué par une flèche, est suivi à travers le temps, comme indiqué ci-dessous (barre d'échelle 200μm). Cette explant a été visualisé par l'imagerie en direct pendant 38 h. On voit ici des images de cellules laissant l'explant à partir du début de l'enregistrement des images pour l'image finale. B) La cellule indiquée dans la partie A à l'heure indiquée. La cellule montre répétitif de branchement (barre d'échelle 50 microns).
Discussion
Nous présentons ici un système simple à étudier et à analyser le comportement migratoire des cellules neuronales en réponse à des signaux chimiques. Dans les essais de migration in vitro ont été utilisés pour identifier des molécules extracellulaires affectant le déplacement des cellules. Notre paradigme assure que chaque cellule individuelle étudiée a un 3-dimensions (3D) environnement avec lequel interagir. C'est un avantage considérable sur les cultures où les cellules migrent hors des explants sont contraints de se déplacer sur la surface plane de la poly-D-lysine lamelle, donc dépourvus d'interactions avec la matrice extracellulaire (par exemple, Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). Cependant par rapport à la plus grande échelle de cellules qui migrent de suivi, il reste deux dimensions, comme les cellules sont contraints à la verticale de l'espace entre la lamelle de verre sur le fond et la surface supérieure de Matrigel, qui est relativement mince par rapport à la liberté horizontale de la migration. Une telle configuration permet de faciliter l'analyse du mouvement, qui reste encore essentiellement deux dimensions. Similaires paradigmes 3D constitué d'explants de GE ou re-agrégats de cellules GE intégrés dans le collagène ou de Matrigel, ont déjà été employées, en utilisant des agrégats de cellules exprimant une protéine particulière de signalisation comme une source de signaux chimiques (par exemple Liodis et al '07;. Martini et .. al '09;. Nóbrega-Pereira et al '08; Wichterle et al '03).. La méthode présentée ici utilise un système à libération lente sous forme de billes de latex avec des protéines respectées pour permettre un niveau soutenu dans l'environnement local, qui est plus élevé que les protéines ajouté directement au milieu, ce qui rend le système particulièrement adapté lorsque la quantité de disponibles protéine est limitée ou quand un mélange complexe de protéines est testé. Les choix de perles est pas limité au latex à base de produits, et comprend également d'autres matériaux par exemple des billes d'agarose, chacun avec différentes caractéristiques. Pour augmenter encore la densité de l'essai, nous avons utilisé deux explants revêtue de dépôt des perles sur les côtés opposés. Afin de garantir une zone spécifique de l'origine, nous avons utilisé des explants éminence ganglionnaire comme une source de cellules. Nous avons évalué les différences dans les parties médiale et latérale de l'éminence ganglionnaire, mais ne voyait aucune différence. Il convient de souligner que cette étude utilise les furets, dans cette espèce, les éminences ganglionnaires médial et latéral fusionner plus tôt que chez les rongeurs (Poluch et al '08.). Au moment où les cultures ont été faites (P0) des éminences ganglionnaires médiale et latérale ont été fusionnées, même si de nombreuses cellules peuplant le néocortex sont toujours générés et la migration. Toutefois, si une source véritablement homogène de cellules est préféré, une suspension cellulaire peut être préparé à partir des tissus disséqués et directement mélangé avec le Matrigel, ou bien filé vers le bas et une pastille résultante poing pour faire 'explants. L'utilisation de la digestion enzymatique des tissus pour préparer la suspension cellulaire est découragé, car même les traces résiduelles de l'activité protéolytique peut liquéfier Matrigel au cours de l'expérience. En outre, une diligence raisonnable doit être appliqué à la synchronisation de la configuration de la culture. Bien Matrigel nécessite une période de réchauffement à polymériser, même une période légèrement étendue de l'exposition des petites gouttes de Matrigel (comme utilisé dans ce protocole) à l'air provoque le séchage et les résultats dans une coquille qui est impénétrable à cellules migrent et qui ne peuvent pas être effacées en couvrant ultérieure avec Matrigel frais.
Disclosures
L'utilisation d'animaux: Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées conformément à l'USUHS et les lignes directrices des NIH institutionnels et approuvé par le IACUC USUHS.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le DoD Grant PT074620 (SLJ) et des subventions du NIH R01NS245014 (SLJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
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