Summary
Zeitraffer-Aufnahme von 3D-Gewebekultur ermöglicht das Studium Zugverhalten von einzelnen Zellen, die aus ganglionären Eminenz in Reaktion auf fraktionierte Proteinextrakt aus Großhirnrinde.
Abstract
Migration von Zellen ist ein gemeinsamer Prozess, der zur Entwicklung und Reifung der Wirbeltiere des zentralen Nervensystems (Hatten, '99) führt. Die Hirnrinde besteht aus zwei grundlegenden neuronalen Typen: erregende und hemmende. Diese Zellen entstehen in unterschiedlichen Bereichen und wandern in die Rinde entlang verschiedener Routen (Pearlman et al., '98). Inhibitorischen Interneuronen tangential von subkortikalen Quellen migrieren, meist aus verschiedenen Regionen des Ganglion Eminenzen (Gelman et al, '09;. Xu et al, '04.). Ihre Bewegung erfordert eine genaue raumzeitliche Kontrolle durch Umweltreize verhängt, um den Aufbau einer ordnungsgemäßen Zytoarchitektur und Konnektivität in der Großhirnrinde zu ermöglichen (Caviness & Rakic, '78, Hatten, '90, Rakic, '90). Zur Untersuchung der Zugverhalten von Zellen in proliferativen Zonen des Ganglion Eminenzen (GE) bei neugeborenen Frettchen in vitro erzeugten verwendeten wir eine 3-dimensionale Kultur Anordnung in einer BD Matrigel Matrix. Die Kultur-Setup bestand aus zwei GE Explantate und eine Quelle der getesteten Proteine aus der Großhirnrinde extrahiert und adsorbiert an fluoreszierenden Latex Retrobeads IX zwischen den Explantaten (Hasling et al, '03.; Riddle et al, '97.) Positioniert. Nach 2-3 Tagen der Kultur, beginnen die Zellen am Rand der Explantation zeigt eine Neigung zu dem Gewebe in radialer Richtung zu verlassen scheinen. Live-Bildgebung erlaubt Beobachtung von wandernden Muster ohne die Notwendigkeit der Etikettierung oder Kennzeichnung der Zellen. Wenn auf Bruchteile des Proteins aus isochrone Frettchen Kortex erhaltene Extrakt ausgesetzt sind, zeigten die GE-Zellen unterschiedliche Verhaltensweisen als durch quantitative kinetische Analyse der einzelnen beweglichen Zellen beurteilt.
Protocol
1. Reagenzvorbereitung
- Eingefrorene Matrigel auf nassem Eis, so dass genügend Zeit vor dem Experiment (nicht den Prozess zu beschleunigen durch aktive Erwärmung). Matrigel verwendet wird, um eine 3D-Umgebung sehr ähnlich einer extrazellulären Matrix förderlich für die Migration von Zellen zu etablieren. Es bietet sowohl Zellen mit einem Substrat und mechanische Ummantelung. Matrigel ist bei -20 ° C. Vor dem Gebrauch sollte es allmählich gebracht werden bis zu einer Temperatur von 0-4 ° C, dh auf nassem Eis oder im Kühlschrank aufgetaut werden. Matrigel irreversibel setzt auf ein Gel in der Temperatur der Inkubation (37 ° C) zu bilden. Daher ist es nicht empfehlenswert, zu beschleunigen Auftauen durch Eintauchen der Behälter in warmes Wasser.
- Protein-Fraktionen werden durch isoelektrische Fokussierung (IEF) der Gesamt-Proteinextrakt aus der Hirnrinde einer postnatalen Tag 0 (P0) Frettchen vorbereitet. Nach der Trennung werden die Fraktionen über Nacht gegen 20 mM Tris-HCl pH 7,2 dialysiert, um die Auszüge aus der Fokussierung Puffer Bestandteilen, die eine toxische Wirkung auf das Gewebe könnte reinigen.
- Protein Delivery-System. Proteine aus der Großhirnrinde extrahiert werden auf fluoreszierenden Latex-Kügelchen, die dann langsam los die Proteine, die environment.We festgestellt, dass die Fluoreszenz-Feature in Visual Umgang mit Mikrosphären hilft und ermöglicht die einfache Erfassung auch minimal-Spillover von der Website des adsorbierten bead Anzahlung, wenn sie unter Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
- Add 10 &mgr; l des fluoreszierenden Beads bis 100-200 ul der Protein-Lösung
- Inkubieren für 30 Minuten im Dunkeln bei RT auf einem Schüttler
- Drehen Sie die Perlen in einer Tischzentrifuge für 1 h bei Höchstgeschwindigkeit
- Überstand entfernen
- In einen Strudel mit 10 &mgr; l frisches Medium resuspendieren
- Fügen Sie 30μl der Matrigel der Suspension, gut mischen und auf Eis stellen.
- Puffer und Medien
- Vorbereiten und Filtration sterilisieren künstlichen Liquor (aCSF; NaCl 124mm, NaHCO 3 26mm, NaH 2 PO 4 1,2 mm, 3,2 mm KCl, MgSO 4 1,2 mm, 2,4 mm CaCl 2, Glucose 10 mM). Slush-freeze die aCSF vorher, so dass es bereit ist zum Zeitpunkt der Gewebedissektion. Um es zu machen, statt einer Kunststoff-Flasche mit steriler aCSF in einem -80 ° C Tiefkühltruhe gefüllt. Monitor Einfrieren jeder so oft, so, wenn eine Schicht aus Eis aufbaut auf der Innenseite der Wand, brechen sie und mischen sich mit der Flüssigkeit. Wiederholen, bis die Flasche enthält meist ein eisiger Matsch. Buffer vorbereitet auf diese Weise unterstützt nicht nur Gewebe Überleben, sondern halten auch niedrigen Temperaturen länger, und ist mechanisch weniger schädlich für das Gewebe als klobige Eiswürfel.
- Bereiten Neurobasal Medium mit N-2 und B-27 ergänzt hinzugefügt nach Herstellerangaben Anregungen sowie 1mg/100ml Gentamycin, 2 mM L-Glutamin und 0,6% Glucose. Sterilisieren durch Filtration durch ein 0,22 &mgr; m-Membran. Halten bei 37 ° C erwärmen bis zur Verwendung.
- Kultur-Platten
- Kultur hochwertigem Kunststoff Sechs-Well-Platten sind durch Punktierung jede Vertiefung in der Mitte mit einer kleinen Menge (ca. 2μl) kaltes Matrigel mit 20 &mgr; l Pipettenspitze und Erteilung eines autoklaviert rund 18mm Deckglas auf jeden Tropfen bereit. Weder die Platten noch die Deckgläser müssen ansonsten Kultur behandelt.
2. Tissue Vorbereitung
- Abrufen des Hirngewebes
- Nach tief anästhesiert das Tier mit Euthasol, entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in eiskaltem aCSF
- Trennen Sie die Halbkugeln mit einem Skalpell und schneiden koronal bei 500 um mit einem Gerät der Wahl, das Sammeln Scheiben in eine kleine Schüssel mit eiskaltem aCSF
- Machen Explantate (Verwendung Präpariermikroskop)
- Identifizieren Scheiben mit den Ganglien-Eminenzen (GE) und trimmen Regionen des Kortex, die über GE curl und stören mit weiteren Schritten können
- Drücken Sie eine Harris Uni-Core Bohrung in der Gegend in der Nähe ventrikuläre Oberfläche des GE-, Fahrwerk-Kern mit überwiegend eine ventrikuläre Zone, und vertreiben sie mit einem Stempel in das Eis-kaltes Medium (Abb.1). Drei bis vier Explantaten von 0,5 mm Durchmesser kann die GE in einzelnen P0 Frettchen Hirnschnitt gemacht werden. Bitte beachten Sie, dass sich sowohl bei Nagetieren und Frettchen, die medialen und lateralen GEs in diesem Alter sind verschmolzen. Wenn ein Kern bleibt in der Scheibe oder auf die Kunststoff-Boden der Schale stecken, mobilisieren sie durch spritzende aCSF mit einer Pipettenspitze und Transfer mit einer Pipette in die Schüssel mit kaltem Neurobasalmedium. Halten Sie die Schale auf nassem Eis.
- Übertragen einer Charge von Explantate aus dem Medium in einem großen Tropfen eiskaltem Matrigel (ca. 0,25-0.5ml) in einer separaten Schale gelegt, wobei darauf zu haben, die Explantate vollständig eingetaucht und die Vermeidung von Blasen. Halten Sie die Schale auf nassem Eis. Die Größe einer Charge hängt von der Geschwindigkeit des Workflows downstream.
3. Kultur-Setup (Verwendung Präpariermikroskop)
- Halten Sie Matrigel und Matrigel-haltigen Mischungen auf Eis, um das Härten zu vermeiden.
- Remix der Beadsuspension und Ort 1-2μl oder weniger der Beadsuspension in eiskaltem Matrigel im Zentrum von einem Deckglas zuvor in einer Kultur Platte gelegt und mit einem 20 &mgr; l Pipettenspitze. Let it Set ein wenig, nicht austrocknet.
- Mit einem 20 &mgr; l Pipettenspitze Pick up 2 Explantate aus dem Matrigel Drop und legen Sie sie in die gewünschte Nähe des Wulstes Anzahlung (mindestens 1 mm von der Kante weg von der Kaution) symmetrisch an den gegenüberliegenden Seiten. Lassen Sie es nicht länger als 5 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt. Das richtige Timing der Schritte b und c ist kritisch. Wenn die Zeit zu kurz wird es zu einer unvollständigen Gelier-und Komponenten der Kultur-Setup führt zu bewegen, wenn sie mit der letzten Schicht von Matrigel abgedeckt sind, wenn die Zeit zu lang ist, kann es in über-Trocknung des Gels und Erstellung von Ergebnis physische Barrieren die freie Bewegung von Zellen.
- Decken Sie die Perlen und das Explantat mit einer flachen Schicht von etwa 30μl der Matrigel, Verlängerung über die Explantate (Abb.2). Lassen Sie es in den Inkubator-Set für etwa 15 Minuten.
- Add 2ml Neurobasalmedium mit Ergänzungen.
- Bei 37 ° C in 5% CO 2 / 95% O 2-Überwachung wandernde Aktivität täglich.
4. Live-Bildgebung
- Nach einer Inkubationszeit von 3-4 Tagen, überprüfen Sie die Kultur-Platten und wählen Deckgläser von Interesse. Die Explantate sollten einen radial gleichmäßige Wolke von Zellen. Ersetzen Sie gewählt Deckgläschen in eine frische Kultur Platte, die in Live-Bildgebung verwendet wird.
- Lassen Sie die Deckgläser sitzen in der neuen Platte über Nacht. Bevor Sie die Platte auf das Mikroskop für die Bildgebung, in einer Zellkultur Kapuze, mit einem sterilen Spatel auf das Deckglas zu bewegen, um jede Mikrobläschen, die zwischen dem Deckglas und der Zellkulturplatte sammeln freizugeben. Interference von Blasen wird Ruine der Bilder. Bewegen Sie den Deckgläschen in die Mitte des Brunnens.
- Um zu verhindern, Verdunstung, füllen den Raum zwischen Brunnen mit Wasser.
- Sorgfältig Übertragung der Platte aus der Zellkultur Haube an das Mikroskop, um nicht zu bewegen die Deckgläser von der Mitte des Brunnens.
- Definieren Sie ein bildgebendes System mit Imaging-Software. Durch die 3D-Charakter der Kultur-Setup die Zellen auch vertikal bewegen, daher ist es wichtig, Z-Ebenen zu sammeln umfasst volle Tiefe der Migration Wolke. Die XY Maße der abgebildeten Bereich sollten auch groß genug, um Bereiche voraussichtlich um wandernden Zellen im Verlauf der Aufzeichnung aufgefüllt werden, zu decken und die Perle Anzahlung enthalten, um eine Winkelausrichtung der Explantation und Migration von Zellen relativ zu erfassen sein die Quelle des Proteins. Sehen Sie sich auch, dass je mehr abgebildet Z-Ebene, oder die mehr Fläche bedeckt, desto mehr Zeit es braucht, um einen Zyklus zu einem bestimmten Zeitpunkt erfassen, zwingt längere Zeitintervalle zwischen den Proben und einem Verlust der zeitlichen Auflösung von Zell-Tracking-Systems. In unserem Fall mit einem 10x-Objektiv wurde die optimale Regelung einer 3x3 Kachel Aufzeichnung für jede der 10 Z-Ebenen im Abstand von 20 um, in Abständen von 30 Minuten. Wir haben 30 Minuten-Intervallen die längste, die eindeutige Identifizierung von Zellen ermöglicht bei aufeinander folgenden Zeitpunkten, die entscheidend für die zuverlässige Verfolgung ihrer Bewegungen ist.
- Initiieren Zeitraffer Bildgebung.
- Nach der gewünschten Zeit, entfernen Sie die Platte und fix Kulturen in 4% Phosphat-gepufferter Paraformaldehyd. Es kann für weitere morphologische und immunzytochemische Analyse verwendet werden.
5. Die Analyse der Bewegung
- Konvertieren Sie die aufgezeichneten Zeitreihen von Bildern in ein Format am besten für die weitere Verarbeitung, TIFF wird die portabel.
- Verfolgen Sie die Bewegung einzelner Zellen im Laufe der Zeit durch die Aufnahme XY-Koordinaten. Dies kann mit frei verfügbarer Software wie ImageJ (NIH) mit einer manuellen Tracking-Plug-in, oder jede andere kommerzielle Anwendung wie ImagePro, Volicity oder AutoQuant werden.
- Zeichnen Sie die Tracks mit Excel oder in-house entwickelter Software.
- Für jede Zelle verfolgt kinetischen Parameter wie beispielsweise die durchschnittliche Geschwindigkeit, Krümmung des Weges, Richtungs-Variabilität im Laufe der Zeit, Verzweigungen, Abweichung zur Quelle von Proteinen zu berechnen, kann etc. Berechnungen in MS Excel oder einer vergleichbaren Tabellenkalkulation durchgeführt werden. Unsere Erfahrung zeigt jedoch, dass es weitaus produktiver, in-house-Skripte (mit R, Matlab, Python, Perl oder andere, meist Open Source Sprachen) zu entwickeln, wie sie für mehr flexible Anpassung und Integration von mehr anspruchsvolle analytische Methoden als jene erlauben in einer Basis-Installation von Excel.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Schematische Darstellung der anatomischen ursprüngn der Explantate. Dies ist eine Zeichnung von einem koronalen Scheibe eines hemisected Frettchen Gehirn. Die grauen Kreise zeigen die Region, aus der die Explantate wurden.
Abbildung 2. Diagram einer Kultur-Setup. Die Wulst Anzahlung ist die Quelle von Proteinen, die Explantate auf beiden Seiten platziert und alle Komponenten sind mit Matrigel abgedeckt.
Abbildung 3. Entsprechende Grundstücke Zelle Tracks von Quadranten (Pfeile weisen auf die Perle Kaution) gefärbt. Die Zelle Tracks auf der rechten Seite in Richtung Fraktion D, die Zellen zu gewinnen scheint die Migration, die Zellen auf der linken Seite in Richtung Fraktion A, die wandernden Zellen abzuwehren scheint die Migration.
Abbildung 4. A) Eine Reihe von Bildern aus ausgewählten Zeitpunkten ein wachsendes Wolke von Zellen wandern aus einem Explantat. Ein Beispiel Zelle, durch einen Pfeil gekennzeichnet ist durch die Zeit verfolgt wie unten angegeben (Maßstab 200 um). Das Explantat wurde mit Live-Bildgebung visualisiert für 38 h. Sehen Sie hier Bilder von Zellen verlassen das Explantat aus dem Beginn der Aufzeichnung der Bilder auf das endgültige Bild. B) Die Zelle in Teil A zu den angegebenen Zeiten. Die Zelle zeigt sich wiederholende Verzweigung (Maßstab 50 um).
Discussion
Hier präsentieren wir ein einfaches System zu studieren und zu analysieren Zugverhalten von neuronalen Zellen als Reaktion auf chemische Reize. In-vitro-Assays Migration wurden verwendet, um extrazelluläre Moleküle, die die Fortbewegung von Zellen zu identifizieren. Unser Paradigma ist sichergestellt, dass jede einzelne Zelle studiert eine 3-dimensionale (3D)-Umgebung, mit denen zu interagieren hat. Es ist ein erheblicher Vorteil gegenüber Kulturen, in denen Zellen wandern aus der Explantate sind gezwungen, auf der flachen Oberfläche der Poly-D-Lysin-beschichtete Deckglas zu bewegen und damit frei von Interaktionen mit der extrazellulären Matrix (zB Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). Doch im Hinblick auf die größere Skala von Tracking wandernden Zellen, bleibt es 2-dimensional, da die Zellen vertikal in den Raum zwischen dem Deckglas auf dem Boden und der Oberseite des Matrigel, die relativ dünn ist im Vergleich zu den horizontalen Freiheit eingeschränkt der Migration. Eine solche Einrichtung ermöglicht eine einfachere Analyse der Bewegung, die immer noch im wesentlichen 2-dimensional. Ähnliche 3D Paradigmen, bestehend aus GE-Explantate oder re-Aggregate von GE-Zellen in Kollagen oder Matrigel eingebettet wurden bisher eingesetzt, wobei Aggregate von Zellen, die ein bestimmtes Signal-Protein als eine Quelle der chemische Reize (z. B. Liodis et al '07;. Martini et .. al '09;. Nóbrega-Pereira et al '08; Wichterle et al '03).. Die hier vorgestellte Methode verwendet eine langsame Freisetzung in Form von Latex-Beads mit eingehalten Proteine für eine nachhaltige Ebene im lokalen Umfeld, die höher sind als Proteine direkt hinzugefügt, um das Medium zu ermöglichen, wodurch das System besonders geeignet, wenn die Menge des verfügbaren Protein ist begrenzt, oder wenn eine komplexe Mischung von Proteinen getestet wird. Die Auswahl der Perlen ist nicht auf Latex-Basis Produkte beschränkt und schließt auch andere Materialien, zum Beispiel Agaroseperlen, die jeweils mit unterschiedlichen Merkmalen. Zur weiteren Erhöhung der Dichte des Tests verwendeten wir zwei Explantate apposed die Perlen Anzahlung auf gegenüberliegenden Seiten. Um sicherzustellen, einer bestimmten Gegend von Herkunft, haben wir ganglionären Eminenz Explantate als eine Quelle der Zellen verwendet. Wir untersuchten Unterschiede in medialen und lateralen Teile des Ganglion Eminenz, aber sehe keine Unterschiede. Wir weisen darauf hin, dass diese Studie Frettchen verwendet; bei dieser Art der medialen und lateralen Ganglion Eminenzen früheren Sicherung als bei Nagetieren (Poluch et al '08.). Zu der Zeit wurden die Kulturen gemacht (P0) den medialen und lateralen Ganglion Eminenzen verschmolzen wurden, obwohl viele Zellen Auffüllen der Neocortex noch erzeugt und Migration. Allerdings, wenn eine wirklich homogene Quelle von Zellen wird bevorzugt, kann eine Zellsuspension aus der sezierten Gewebe hergestellt werden und direkt mit dem Matrigel gemischt, oder alternativ abzentrifugiert und eine daraus resultierende Pellet gestanzt, um "Explantate" zu machen. Verwendung von enzymatischen Gewebe Verdauung zu der Zellsuspension vorbereitet wird abgeraten, denn selbst Restspuren von proteolytischer Aktivität kann verflüssigen sich im Laufe des Experiments Matrigel. Außerdem wurde eine Due Diligence auf den Zeitpunkt des Kultur-Setup verwendet werden. Obwohl Matrigel erfordert einen Zeitraum von Erwärmung zur Polymerisation, auch eine etwas längere Belichtung von kleinen Tropfen Matrigel (wie in diesem Protokoll), um die Luft verursacht Trocknung und resultiert in einer Schale, die undurchdringlich wandernden Zellen ist und kann nicht gelöscht werden durch nachträgliche Abdecken mit frischen Matrigel.
Disclosures
Tierversuche: Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den USUHS und NIH institutionellen Richtlinien durchgeführt und von der USUHS IACUC.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom DoD Stipendium PT074620 (SLJ) und NIH Grant R01NS245014 (SLJ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
- Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice. Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).
- Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons. J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).
- Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia. Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).
- Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis. Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).
- Hatten, M. E. Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain. Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).
- Hatten, M. E. Central nervous system neuronal migration. Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).
- Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).
- Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development. Development. 134, 2815-2827 (2007).
- Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. , 136-1341 (2009).
- Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, 733-745 (2008).
- Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. New directions for neuronal migration. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).
- Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia. Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres. Biotechniques. 23, 928-937 (1997).
- Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).
