Summary
זמן לשגות הדמיה של התרבות רקמת 3D מאפשר ללמוד התנהגות הנדידה של תאים בודדים שמקורם רוממות ganglionic בתגובה תמצית חלבון מופרדים מן קליפת המוח.
Abstract
הגירה של תאים הוא תהליך משותף שמוביל לפיתוח ההבשלה של מערכת החולייתנים העצבים המרכזית (Hatten, 99). קליפת המוח מורכבת משני סוגי נוירונים בסיסיים: הגירוי ואת מעכבות. תאים אלה מתעוררות באזורים שונים ולנדוד לתוך קליפת בנתיבים שונים (פרלמן et al., 98). Interneurons מעכבות להעביר בעקיפין, ממקורות קורטיקליים, רובם מאזורים שונים של יואילו הוד מעלתם ganglionic (גלמן ואח', '09;. שו ואח', '04.). התנועה שלהם מחייב שליטה מדויקת spatiotemporal שהוטלו על ידי רמזים סביבתיים, כדי לאפשר הקמת cytoarchitecture קישוריות נאותה בקליפת המוח (Caviness & Rakic, 78; Hatten, 90; Rakic, 90). כדי לחקור את התנהגות הנדידה של תאים שנוצר באזורי שגשוג של יואילו הוד מעלתם ganglionic (GE) ב חמוסים היילוד במבחנה השתמשנו הסדר 3 התרבות ממדי Matrigel BD מטריקס. הגדרת התרבות מורכבת משני explants GE ו מקור חלבונים נבדק מופק בקליפת המוח ואת adsorbed על פלורסנט Retrobeads לטקס התשיעי ממוקם בין explants (Hasling ואח', '03;. Riddle et al, 97.). לאחר 2-3 ימים של תרבות, התאים מתחילים להופיע בקצה explant מראה נטייה לעזוב את רקמת בכיוון רדיאלי. הדמיה חיה מותר תצפית דפוסי הנדידה ללא צורך תיוג או סימון התאים. כאשר נחשף שברים של החלבון לחלץ המתקבל קליפת החמוס isochronic, התאים GE מוצג התנהגויות שונות כמו להישפט על ידי ניתוח כמותי הקינטית של תאים בודדים נעים.
Protocol
1. מגיב הכנה
- הפשירי Matrigel קפוא על קרח רטוב, ומשאיר מספיק זמן לפני הניסוי (אין להאיץ את התהליך על ידי חימום פעיל). Matrigel משמש להקים סביבת 3D הדומה תאי מטריקס תורמת הנדידה של התאים. הוא מספק תאים עם שני מצע מכני encasing. Matrigel מאוחסן קפוא ב -20 ° C. לפני השימוש, זה צריך להיות הביאה בהדרגה עד לטמפרטורה של 0-4 מעלות צלזיוס, כלומר מופשר על קרח רטוב או במקרר. Matrigel בלתי הפיך סטים כדי ליצור ג'ל בטמפרטורה של הדגירה (37 ° C). לכן לא מומלץ לזרז את הפשרת ידי טבילה את המיכל במים חמים.
- שברים חלבון מוכנים ידי התמקדות isoelectric (IEF) של תמצית החלבון הכולל של קליפת המוח של יום הלידה 0 (P0) החמוס. לאחר ההפרדה, שברים הם dialyzed לילה נגד pH7.2 20mm טריס-HCl כדי לנקות את קטעים המרכיבים חיץ התמקדות, אשר עשוי להיות רעיל הרקמה.
- אספקת חלבון המערכת. חלבונים מופק בקליפת המוח הם adsorbed על חרוזים לטקס פלורסנט אשר ואז לאט לאט לשחרר את החלבונים עד environment.We מצאו כי התכונה הקרינה מסייעת בטיפול החזותי של microspheres ומאפשר זיהוי קל של גלישת אפילו מינימלי מהאתר של חרוז ההפקדה, כאשר צפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- הוסף 10μl של חרוזי ניאון 100-200μl של פתרון חלבון
- דגירה של 30 דקות בחושך ב RT על שייקר
- ספין החרוזים מטה בצנטריפוגה ספסל עבור 1 שעות בבית מהירות מרבית
- הסר supernatant
- Re-להשעות במערבולת באמצעות 10μl של מדיום חדש
- הוסף 30μl של Matrigel על ההשעיה, ומערבבים היטב, ומניחים על קרח.
- Buffers התקשורת
- הכן סינון לעקר מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF; NaCl 124mM, NaHCO 3 26mM, לאא 2 PO 4 1.2 מ"מ, KCl 3.2mM, MgSO 4 1.2 מ"מ, CaCl 2 2.4mM, גלוקוז 10mm). סלאש, להקפיא את aCSF מראש, כך שזה מוכן בזמן דיסקציה רקמות. כדי לעשות את זה, במקום בקבוק פלסטיק מלא aCSF סטרילי בתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס. צג הקפאת כל כך הרבה פעמים, אז מתי שכבת הקרח מצטבר על הצד הפנימי של הקיר, לשבור אותו לערבב עם הנוזל. חזור על הפעולה עד הבקבוק מכיל בעיקר ברד קפוא. מאגר מוכן בדרך זו לא רק תומך הישרדות רקמות, אלא גם להחזיק בטמפרטורה נמוכה יותר, היא מכנית פחות מזיק לרקמות מאשר קוביות קרח עבה.
- הכן בינוני Neurobasal עם N-2 ו-B-27 תוספי הוסיף על פי הצעות של היצרן, כמו גם 1mg/100ml gentamycin, 2 מ"מ L-גלוטמין, וגלוקוז 0.6%. לעקר על ידי סינון דרך קרום 0.22μm. להתחמם על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- תרבות צלחות
- כיתה תרבות פלסטיק שש צלחות מוכנים היטב על ידי מנקדים כל טוב במרכזו עם כמות קטנה (כ 2μl) של Matrigel קר באמצעות קצה 20μl פיפטה, ומיקום coverslip autoclaved עגול זכוכית 18mm על כל טיפה. גם הצלחות וגם coverslips צריכים להיות מטופלים אחרת תרבות.
2. רקמות הכנה
- קבלת רקמת המוח
- לאחר הרדמה עמוקה החיה עם Euthasol, להסיר את המוח למקם אותו קר כקרח aCSF
- הפרד את ההמיספרות עם אזמל פרוסה coronally ב 500μm באמצעות מכשיר של בחירה, איסוף פרוסות לתוך צלחת קטנה ובה קר כקרח aCSF
- Explants ביצוע (שימוש במיקרוסקופ לנתח)
- זהה את פרוסות המכיל את יואילו הוד מעלתם ganglionic (GE) ואזורים קיצוץ של קליפת המוח אשר עשויה תלתל על GE ו להפריע צעדים נוספים
- לחץ על האריס Uni-Core נשא באזור קרוב לפני השטח חדרית של GE, לחזור בו גרעין המכילה בעיקר אזור חדרית, ולגרש את זה עם הבוכנה לתוך מדיום קר כקרח (תמונה 1). שלוש עד ארבע explants של 0.5 בקוטר מ"מ יכול להתבצע מן GE חד פרוסה P0 במוח החולדה. שים לב הן מכרסמים חמוסים, GES המדיאלי ו לרוחב הם התמזגו בגיל זה. אם הליבה נשארת פרוסה או תקוע לתחתית הפלסטיק של המנה, לגייס אותו באמצעות התזת aCSF עם קצה פיפטה ולהעביר עם טפטפת לתוך תבשיל המכיל בינוני Neurobasal קר. שמור את המנה על קרח רטוב.
- העברת קבוצה של explants מן המדיום תוך ירידה גדולה של קר כקרח Matrigel (כ 0.25-0.5ml) להציב צלחת נפרדת, מקפיד להיות explants שקוע לחלוטין והימנעות בועות. שמור את המנה על קרח רטוב. גודל אצווה תלוי במהירות של זרימת הזרם.
3. הגדרת התרבות (שימוש במיקרוסקופ לנתח)
- שמור תמיד Matrigel ו Matrigel המכילים תערובות על הקרח, כדי למנוע ריפוי.
- Remix ההשעיה מקום חרוז 1-2μl או פחות ההשעיה חרוז Matrigel קר כקרח במרכז coverslip כוס ממוקם בעבר צלחת תרבות היטב באמצעות קצה פיפטה 20μl. תן לזה קצת להגדיר, למנוע התייבשות.
- בעזרת קצה 20μl פיפטה להרים 2 explants מירידה Matrigel ולמקם אותם באזור הרצוי של ההפקדה חרוז (לפחות 1 מ"מ מהקצה הפיקדון) באופן סימטרי משני צדי. תן לו לקבוע לא יותר 5min בטמפרטורת החדר. העיתוי הנכון של צעדים B ו-C הוא קריטי. אם הזמן קצר מדי זה יוביל gelling ורכיבים חלקית של הגדרת התרבות יעברו כאשר הם מכוסים שכבה הסופי של Matrigel, אם הזמן ארוך מדי זה עלול לגרום לייבוש יתר של הג'ל ויצירת מחסומים פיזיים הפגיעה תנועה חופשית של תאים.
- מכסים את החרוזים ואת explant בשכבה שטוחה של כ 30μl של Matrigel, להאריך אותו מעבר explants (Fig.2). תן לו לקבוע בחממה כ -15 דקות.
- הוסף 2ml של המדיום Neurobasal עם תוספי מזון.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 5% O 2 / 95 2% פעילות ניטור נודדות מדי יום.
4. חיים הדמיה
- לאחר דגירה של 3-4 ימים, עיין צלחות תרבות לבחור coverslips של עניין. Explants צריך ליצור ענן אחיד רדיאלית של תאים. החלף coverslips נבחר לתוך צלחת תרבות טריים אשר ישמשו בתחום ההדמיה לחיות.
- בואו coverslips יושבים צלחת החדש במשך הלילה. לפני הצבת צלחת על המיקרוסקופ הדמיה, במנדף תרבית תאים, השתמש מרית סטרילי כדי להזיז את coverslip על מנת לשחרר את כל microbubbles שאוספות בין coverslip ואת צלחת תרבית תאים. התערבות של בועות יהרוס את התמונות. הזז את coverslips למרכז הבאר.
- כדי למנוע אידוי, למלא את החלל בין בארות מים.
- להעביר בזהירות את הצלחת ממכסה המנוע התרבות התאים במיקרוסקופ לא להעביר את coverslips ממרכז הבאר.
- הגדרת ערכת הדמיה באמצעות תוכנת הדמיה. בשל אופייה 3D של הגדרת התרבות התאים גם להזיז אנכית, ולכן חשוב לאסוף Z-המטוסים המקיף עומק מלא ענן ההגירה. היקף XY האזור צילמו צריך להיות גם קבוצה גדולה מספיק כדי לכסות אזורים צפוי להיות מאוכלס על ידי תאים נודדים במהלך ההקלטה, כדי להכיל את הפיקדון חרוז כדי להקליט אוריינטציה זוויתי של explant לבין תאים נודדים יחסית מקור החלבון. כמו כן רואים כי המטוסים צילמו יותר Z, או את האזור מכוסה יותר, יותר זמן זה לוקח להקליט מחזור בנקודת זמן מסוימת, מכריח מרווחי הזמן בין דגימות עוד הפסד של רזולוציה הזמני של מעקב התא. במקרה שלנו, באמצעות המטרה 10x, את ערכת אופטימלי היה הקלטה אריח 3x3 עבור כל אחד 10 Z-המטוסים מרווחים כל 20μm, במרווחים של 30 דקות. מצאנו 30 דקות במרווחים הארוך ביותר המאפשרת זיהוי חד משמעי של תאים בנקודות זמן רצופים, שהוא קריטי עבור מעקב אמין של תנועותיהם.
- ליזום לשגות הדמיה הזמן.
- לאחר זמן הרצוי, להסיר את הצלחת לתקן התרבויות 4% פוספט שנאגרו paraformaldehyde. זה יכול לשמש לניתוח מורפולוגי נוסף immunocytochemical.
5. ניתוח של התנועה
- המרת סדרת זמן מוקלט של תמונות לפורמט הנוח ביותר לעיבוד נוסף, TIFF להיות אחד נייד ביותר.
- עקוב אחר תנועה של תאים בודדים לאורך זמן על ידי קואורדינטות XY הקלטה. ניתן לעשות זאת באמצעות תוכנה להורדה חופשית כמו ImageJ (NIH) עם מעקב ידני plug-in, או כל יישום מסחריים אחרים כגון ImagePro, Volicity או AutoQuant.
- מגרש את הרצועות באמצעות Excel או in-house תוכנה שפותחה.
- עבור כל תא מעקב לחשב פרמטרים קינטיים כגון המהירות הממוצעת, עקמומיות של נתיב, השתנות כיוונית לאורך זמן, מסתעפת, סטייה לכיוון מקור של חלבונים, חישובים וכו 'יכול להיעשות MS Excel גיליון אלקטרוני או כל שווה ערך. הניסיון שלנו מראה זאת כי זה הרבה יותר פרודוקטיביים לפתח בתוך הבית סקריפטים (באמצעות R, Matlab, Python, Perl או אחרות, בעיקר שפות קוד פתוח), מאחר שהם מאפשרים התאמה אישית גמישים יותר הכללת שיטות אנליטיות מתוחכמות יותר מאלה זמין התקנה בסיסית של Excel.
6. נציג תוצאות:
באיור 1. תרשים של origi אנטומיn של explants. זהו ציור של פרוסת העטרה של מוח החולדה hemisected. עיגולים אפורים לציין את האזור שממנו explants נלקחו.
איור 2. דיאגרמה של ההתקנה תרבות. הפיקדון חרוז הוא מקור חלבונים; explants ממוקמים משני צדי וכל האלמנטים מכוסים Matrigel.
איור 3. מגרשים מסלולים מקבילים תא בצבע ידי הרביעים (חיצים לעבר נקודת הפיקדון חרוז). מסלולים התא בצד ימין הם נודדים כלפי חלק ד ', המופיע למשוך תאים, התאים בצד שמאל הן נודדות לעבר חלק, המופיע להדוף תאים נודדים.
איור 4. א ') סדרה של תמונות שנבחרו timepoints מראה ענן גדל והולך של תאים נודדים מתוך explant. התא, למשל, מצוין על ידי חץ, היא מעקב באמצעות זמן כמפורט להלן (פס בהיקף 200μm). Explant זה היה דמיינו עם הדמיה לחיות 38 ח המוצג כאן הן תמונות של תאים עוזב את explant מתחילת ההקלטה תמונות התמונה הסופית. B) התא המצוין חלק בזמנים המצוין. תא מראה הסתעפות חוזרות (בר סולם 50μm).
Discussion
כאן אנו מציגים מערכת פשוטה ללמוד ולנתח את התנהגות הנדידה של תאים עצביים בתגובה לאותות כימיים. ב מבחני חוץ גופית הגירה שימשו כדי לזהות מולקולות תאיים המשפיעים על תנועה של תאים. הפרדיגמה שלנו מבטיחה כי כל תא יחיד למד יש 3 מימדי (3D) בסביבה שבה לתקשר. זהו יתרון משמעותי על פני תרבויות שבה תאים נודדים מתוך explants נאלצים לנוע על המשטח השטוח של coverslip poly-D-ליזין מצופה, נטול ובכך של אינטראקציות עם תאי המטריצה (למשל הירשברג ואח' '10:. 8. Metin et al. '07). עם זאת ביחס בקנה מידה גדול יותר של תאים נודדים מעקב, הוא נשאר 2 מימדי, כמו תאים מוגבלים במאונך לשטח שבין coverslip הזכוכית בתחתית ואת המשטח העליון של Matrigel, שהוא דק יחסית חופש האופקי ההגירה. התקנה כזו מאפשרת ניתוח קל של התנועה, אשר נותר בעיקרו 2 מימדי. פרדיגמות 3D דומים המורכב explants GE או מחדש אגרגטים של תאים GE מוטבע קולגן או Matrigel, היו מועסקים בעבר באמצעות אגרגטים של תאים לבטא חלבון איתות מסוים כמקור לאותות כימיים (למשל Liodis ואח' '07;. מרטיני et .. א '09:. Nóbrega-Pereira et al '08, '03 Wichterle et al).. השיטה המוצגת כאן משתמשת במערכת שחרור איטי בצורה של חרוזים לטקס עם חלבונים דבק כדי לאפשר רמת מתמשכת בסביבה המקומית, שהוא גבוה יותר מאשר חלבונים הוסיף ישירות בינוני, מה שהופך את המערכת מתאימה במיוחד כאשר כמות זמין חלבון מוגבלת או כאשר תערובת מורכבת של חלבונים נבדק. הבחירה של חרוזים אינה מוגבלת לטקס מוצרים מבוססי, והוא כולל גם חומרים אחרים, למשל חרוזים agarose, כל אחד עם מאפיינים שונים. כדי להגביר עוד יותר את הצפיפות של assay, השתמשנו בשני explants apposed להפקיד החרוזים משני צדי המתרס. כדי להבטיח אזור מסוים המוצא, השתמשנו explants רוממות ganglionic כמקור של תאים. הערכנו הבדלים מנות המדיאלי ו לרוחב של מקורבו ganglionic, אבל לא רואה שום הבדלים. עלינו להדגיש כי מחקר זה משתמש חמוסים, במינים זה יואילו הוד מעלתם ganglionic המדיאלי ו לרוחב הפתיל מוקדם יותר מאשר אצל מכרסמים (Poluch ואח' '08.). באותו זמן התרבויות נוצרו (P0) יואילו הוד מעלתם ganglionic המדיאלי ו לרוחב היו התמזגו, למרות תאים רבים לאכלוס הניאוקורטקס עדיין נמצאים שנוצר נודדות. עם זאת, אם מקור אחיד של תאים באמת עדיף, השעיה תא יכול להיות מוכן מרקמת גזור מעורב ישירות עם Matrigel, או לחילופין הסתחרר למטה גלולה כתוצאה אגרוף לעשות "explants". השימוש לעיכול רקמת האנזימטית להכין את ההשעיה התא הוא מיואש, אפילו עקבות של פעילות שיורית proteolytic יכול לנזל Matrigel במהלך הניסוי. כמו כן, בדיקת נאותות צריך להיות מיושם על העיתוי של הגדרת התרבות. למרות Matrigel דורש תקופה של התחממות אל לפלמר, אפילו תקופה ממושכת מעט החשיפה של טיפות קטנות של Matrigel (משמש בפרוטוקול זה) לאוויר גורמת ייבוש תוצאות פגז כי הוא בלתי חדיר לתאי נודדות אשר לא ניתן למחוק על ידי כיסוי הבאים עם Matrigel טריים.
Disclosures
שימוש בבעלי חיים: כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים בוצעו בהתאם USUHS והנחיות NIH מוסדיים אושרה על ידי IACUC USUHS.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי DoD גרנט PT074620 (SLJ) ו-NIH גרנט R01NS245014 (SLJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
- Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice. Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).
- Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons. J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).
- Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia. Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).
- Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis. Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).
- Hatten, M. E. Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain. Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).
- Hatten, M. E. Central nervous system neuronal migration. Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).
- Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).
- Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development. Development. 134, 2815-2827 (2007).
- Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. , 136-1341 (2009).
- Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, 733-745 (2008).
- Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. New directions for neuronal migration. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).
- Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia. Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres. Biotechniques. 23, 928-937 (1997).
- Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).
