Summary
समय चूक इमेजिंग 3D टिशू कल्चर के प्रमस्तिष्क प्रांतस्था से fractionated प्रोटीन निकालने के लिए प्रतिक्रिया में अलग - अलग ganglionic श्रेष्ठता से प्रारंभिक कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का अध्ययन करने की अनुमति देता है.
Abstract
प्रवासन कक्षों की एक सामान्य प्रक्रिया है कि हड्डीवाला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास और परिपक्वता (Hatten, '99) की ओर जाता है है. उत्तेजक और निरोधात्मक: प्रमस्तिष्क प्रांतस्था के दो बुनियादी neuronal प्रकार के होते हैं. इन कोशिकाओं को अलग क्षेत्रों में उठता है और विभिन्न मार्गों (पर्लमैन एट अल., '98) के साथ प्रांतस्था में प्रवास . निरोधात्मक interneurons subcortical स्रोतों से tangentially ganglionic eminences (. Xu एट अल, '04. Gelman एट अल, '09) के विभिन्न क्षेत्रों से ज्यादातर विस्थापित. (; Hatten, '90, Rakic, '90 Caviness और Rakic, '78) उनके आंदोलन सटीक spatiotemporal पर्यावरण cues द्वारा लगाए गए, उचित cytoarchitecture और प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में कनेक्टिविटी की स्थापना के लिए अनुमति देने के नियंत्रण की आवश्यकता है. इन विट्रो में नवजात ferrets में ganglionic eminences (जीई) के proliferative क्षेत्रों में उत्पन्न कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का अध्ययन करने के लिए हम एक बी.डी. Matrigel मैट्रिक्स में एक 3 आयामी संस्कृति व्यवस्था का इस्तेमाल किया. संस्कृति सेटअप दो जीई explants और प्रमस्तिष्क प्रांतस्था से निकाली और फ्लोरोसेंट लाटेकस Retrobeads नौवीं explants (. Riddle एट अल, '97 एट अल Hasling, '03) के बीच तैनात adsorbed पर परीक्षण प्रोटीन का एक स्रोत शामिल . संस्कृति के 2-3 दिनों के बाद, कोशिकाओं एक रेडियल दिशा में ऊतक छोड़ प्रवृत्ति दिखा explant के किनारे पर प्रदर्शित होने लगते हैं. लाइव इमेजिंग लेबलिंग या अंकन कोशिकाओं की आवश्यकता के बिना प्रवासी पैटर्न के निरीक्षण की अनुमति दी. जब निकालने isochronic फेर्रेट प्रांतस्था से प्राप्त प्रोटीन के भागों को उजागर, जीई कोशिकाओं को अलग व्यवहार के रूप में व्यक्तिगत कोशिकाओं के मात्रात्मक गतिज विश्लेषण द्वारा न्याय का प्रदर्शन किया.
Protocol
1. अभिकर्मक तैयारी
- पिघलना Matrigel गीला बर्फ पर जमी प्रयोग (सक्रिय वार्मिंग द्वारा प्रक्रिया को गति नहीं) से पहले पर्याप्त समय छोड़ने Matrigel एक 3D पर्यावरण निकट एक बाह्य मैट्रिक्स कोशिकाओं के प्रवास के लिए अनुकूल जैसी स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.. यह दोनों एक सब्सट्रेट और यांत्रिक encasing के साथ कोशिकाओं प्रदान करता है . Matrigel संग्रहीत किया जाता है -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए पिछले उपयोग करने के लिए, यह धीरे धीरे 0-4 के तापमान के लिए किया जाना चाहिए लाया डिग्री सेल्सियस, यानी गीला बर्फ पर या एक रेफ्रिजरेटर में thawed . Matrigel अचल ऊष्मायन (37 डिग्री सेल्सियस) के तापमान में एक जेल के रूप में सेट है. इसलिए यह करने के लिए गर्म पानी में डुबो कंटेनर द्वारा विगलन गति की सिफारिश नहीं है.
- प्रोटीन भिन्न प्रसव के बाद दिन (P0) 0 फेर्रेट के मस्तिष्क प्रांतस्था से कुल प्रोटीन निकालने के isoelectric ध्यान केंद्रित (IEF) द्वारा तैयार कर रहे हैं. जुदाई के बाद, भिन्न रातोंरात 20mm Tris - एचसीएल pH7.2 के खिलाफ dialyzed कर रहे हैं ध्यान केंद्रित बफर घटक है, जो ऊतकों को विषाक्त हो सकता है से अर्क साफ.
- प्रोटीन वितरण प्रणाली. प्रमस्तिष्क प्रांतस्था से निकाले प्रोटीन फ्लोरोसेंट लाटेकस मोती है जो फिर धीरे पाया कि प्रतिदीप्ति सुविधा microspheres के दृश्य से निपटने में मदद करता है और की साइट से भी न्यूनतम spillovers का आसान पता लगाने की अनुमति देता है environment.We प्रोटीन रिहाई adsorbed पर हैं मनका जमा, जब फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे देखा.
- 100 - 200μl प्रोटीन समाधान के लिए फ्लोरोसेंट मोतियों की 10μl जोड़ें
- आरटी पर अंधेरे में 30min के लिए एक प्रकार के बरतन पर सेते
- मोती स्पिन नीचे 1hr के लिए एक बेंच अपकेंद्रित्र में अधिकतम गति पर
- सतह पर तैरनेवाला निकालें
- एक ताजा माध्यम के 10μl का उपयोग भंवर में पुनः निलंबित
- निलंबन Matrigel के 30μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से, और बर्फ पर जगह.
- Buffers और मीडिया
- कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF, NaCl 124mM, NaHCO 3 26mm, नाह 2 4 पीओ 1.2mm, KCl 3.2mm, MgSO 1.2mm 4, CaCl 2 2.4mm, ग्लूकोज 10mm) तैयार करें और निस्पंदन - बाँझ. कीचड़ पहले से aCSF फ्रीज, तो यह ऊतक विच्छेदन के समय पर तैयार है के लिए इसे बनाने के लिए. -80 ° सी फ्रीजर में बाँझ aCSF के साथ एक प्लास्टिक भरा फ्लास्क जगह है. हर तो अक्सर ठंड मॉनिटर, इसलिए जब बर्फ की एक परत के अंदर दीवार पर अप बनाता है, इसे तोड़ने के लिए और तरल पदार्थ के साथ मिश्रण. दोहराएँ जब तक फ्लास्क ज्यादातर एक बर्फीले कीचड़ होता है . बफर तैयार इस तरह से न केवल ऊतक अस्तित्व का समर्थन करता है, लेकिन यह भी अब कम तापमान का आयोजन करेगा, और यंत्रवत् कम chunky बर्फ cubes से ऊतक के लिए हानिकारक है.
- साथ Neurobasal मध्यम तैयार N-2 और बी 27 की खुराक निर्माता के सुझाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 1mg/100ml gentamycin, 2 मिमी एल glutamine, और 0.6% ग्लूकोज के अनुसार जोड़ा. एक 0.22μm झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन द्वारा जीवाणुरहित. 37 पर गर्म रखें ° उपयोग करें जब तक सी.
- संस्कृति प्लेटों
- संस्कृति ग्रेड प्लास्टिक छह अच्छी तरह प्लेटें इसके केंद्र इलाके में ठंड Matrigel के 20μl विंदुक टिप का उपयोग कर एक छोटी राशि (2μl बारे में) के साथ हर अच्छी तरह से, और एक बूंद पर एक autoclaved दौर 18mm कांच coverslip रखने के द्वारा तैयार कर रहे हैं. न तो प्लेटों और न ही coverslips अन्यथा संस्कृति इलाज की जरूरत है.
2. ऊतक तैयारी
- मस्तिष्क के ऊतकों प्राप्त
- गहरा Euthasol साथ जानवर anesthetizing के बाद, मस्तिष्क को हटा दें और इसे ठंडा aCSF में जगह
- एक स्केलपेल के साथ अलग गोलार्द्धों और पसंद का एक डिवाइस का उपयोग 500μm पर coronally टुकड़ा, एक छोटे से बर्फ की ठंड aCSF युक्त डिश में स्लाइस का संग्रह
- बनाना explants (विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें)
- Ganglionic eminences (जीई) और प्रांतस्था का ट्रिम क्षेत्रों युक्त स्लाइस पहचानें कि जीई अधिक कर्ल और आगे कदम के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं
- प्रेस हैरिस विश्वविद्यालय कोर जीई के निलय की सतह के पास के क्षेत्र में बोर, एक मुख्य रूप से एक निलय क्षेत्र युक्त कोर वापस लेना, और एक सवार के साथ यह ठंडा मध्यम (Fig.1) में निष्कासित 0.5 के तीन से चार explants. मिमी व्यास एकल P0 फेर्रेट मस्तिष्क टुकड़ा में जीई से बनाया जा सकता है. कृपया ध्यान दें कि दोनों rodents और ferrets में, इस उम्र में औसत दर्जे का है और पार्श्व GES में जुड़े हुए हैं. यदि एक कोर टुकड़ा में रहता है या प्लास्टिक पकवान के नीचे करने के लिए अटक है, यह एक विंदुक टिप और ठंड Neurobasal मध्यम युक्त पकवान में स्थानांतरण एक विंदुक के साथ साथ aCSF squirting द्वारा जुटाने . गीला बर्फ पर पकवान रखें.
- Explants के माध्यम से ठंडा Matrigel के एक बड़े ड्रॉप (के बारे में 0.25 0.5ml) एक अलग पकवान में रखा में एक बैच, स्थानांतरण ख्याल रख रही explants पूरी तरह से डूब और बुलबुले से बचने के लिए है. गीला बर्फ पर पकवान रखें. एक बैच का आकार वर्कफ़्लो बहाव की गति पर निर्भर करता है.
3. संस्कृति सेटअप (विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें)
- हमेशा Matrigel और बर्फ पर Matrigel युक्त घोला जा सकता है रखने के लिए इलाज से बचने.
- रीमिक्स मनका निलंबन और जगह एक गिलास पहले एक संस्कृति की थाली में रखा अच्छी तरह से एक 20μl विंदुक टिप का उपयोग कर coverslip के केंद्र में बर्फ ठंड Matrigel में मनका निलंबन की 1-2μl या कम. चलो इसे एक छोटे से सेट, सुखाने से बचें.
- एक 20μl विंदुक टिप का उपयोग Matrigel बूंद से 2 explants लेने और उन्हें मनका जमा के आसपास के क्षेत्र में वांछित जगह (कम से कम 1mm जमा के किनारे से दूर) के विपरीत पक्षों पर संतुलित. यह कमरे के तापमान पर कोई 5min की तुलना में अब के लिए सेट चरणों का सही समय ख और ग महत्वपूर्ण है . यदि समय बहुत कम है यह अधूरा और संस्कृति की स्थापना के बीच बढ़िया तालमेल घटकों का नेतृत्व करेंगे जब वे Matrigel के अंतिम परत के साथ कवर कर रहे हैं कदम होगा, अगर समय बहुत लंबा है यह जेल और के सृजन के सुखाने में परिणाम कर सकते हैं शारीरिक बाधाओं बाधा कोशिकाओं की मुक्त आवाजाही की.
- के बारे में 30μl Matrigel के एक फ्लैट परत के साथ माला और explant कवर, यह explants (Fig.2) से परे का विस्तार. के बारे में 15 मिनट के लिए चलो यह इनक्यूबेटर में सेट है.
- की खुराक के साथ Neurobasal माध्यम के 2ml जोड़ें.
- में 5% सीओ डिग्री सेल्सियस हे 2 / 95% 2 निगरानी प्रवासी गतिविधि दैनिक 37 सेते हैं.
4. लाइव इमेजिंग
- 3-4 दिनों के लिए ऊष्मायन के बाद, संस्कृति प्लेटों की समीक्षा और ब्याज की coverslips चुनें. explants कक्षों की एक त्रिज्यात वर्दी बादल उत्पन्न करनी चाहिए. एक ताजा संस्कृति की थाली है कि रहते इमेजिंग में इस्तेमाल किया जाएगा में चुना coverslips बदलें.
- चलो coverslips रात से अधिक नए थाली में बैठते हैं. खुर्दबीन इमेजिंग के लिए थाली पर रखने से पहले, एक सेल संस्कृति हुड में, एक बाँझ रंग का उपयोग coverslip ले जाने के क्रम में किसी भी microbubbles कि coverslip और सेल संस्कृति प्लेट के बीच में इकट्ठा जारी है. बुलबुले के हस्तक्षेप छवियों को बर्बाद कर देगा. अच्छी तरह से केंद्र के लिए coverslips ले जाएँ.
- वाष्पीकरण को रोकने के लिए पानी के साथ कुओं के बीच के स्थान को भरने के.
- ध्यान सेल संस्कृति हुड से खुर्दबीन के लिए थाली हस्तांतरण के रूप में अच्छी तरह से केंद्र से coverslips स्थानांतरित करने के लिए नहीं.
- एक इमेजिंग इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर योजना को परिभाषित संस्कृति की स्थापना के 3D प्रकृति के कारण कोशिकाओं को भी खड़ी ले जाने के, इसलिए यह महत्वपूर्ण है z-विमानों इकट्ठा प्रवास बादल से भरा गहराई को शामिल. Imaged क्षेत्र के XY हद तक भी काफी बड़े पलायन कोशिकाओं द्वारा रिकॉर्डिंग के दौरान आबादी, भविष्यवाणी क्षेत्रों को कवर करने के लिए और मनका जमा होते क्रम में explant का एक कोणीय अभिविन्यास और पलायन कोशिकाओं के सापेक्ष रिकॉर्ड सेट किया जाना चाहिए प्रोटीन के स्रोत. यह भी विचार है कि अधिक imaged जेड शिल्प, या अधिक क्षेत्र को कवर, और अधिक बार यह एक विशेष समय के बिंदु पर एक चक्र रिकॉर्ड, नमूने और सेल ट्रैकिंग के अस्थायी समाधान की एक हानि के बीच लंबे समय अंतराल मजबूर लेता. हमारे मामले में, एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर, इष्टतम योजना Z-विमानों 30min के अंतराल पर हर 20μm दूरी 10 में से प्रत्येक के लिए 3x3 टाइल रिकॉर्डिंग थी. हम 30 मिनट के अंतराल सबसे लंबे समय तक कि लगातार समय अंक, जो उनके आंदोलनों के विश्वसनीय ट्रैकिंग लिए महत्वपूर्ण है पर कक्षों की स्पष्ट पहचान की अनुमति देता है पाया.
- समय व्यतीत इमेजिंग आरंभ करें.
- वांछित समय के बाद, थाली हटा और 4% फॉस्फेट-buffered paraformaldehyde में संस्कृतियों ठीक. यह आगे morphological और immunocytochemical के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. आंदोलन का विश्लेषण
- आगे प्रसंस्करण के लिए सबसे सुविधाजनक स्वरूप है, झगड़ा सबसे पोर्टेबल जा रहा में दर्ज की छवियों के समय की श्रृंखला में कनवर्ट करें.
- रिकॉर्डिंग XY निर्देशांक द्वारा समय पर व्यक्ति की कोशिकाओं के आंदोलन को ट्रैक. यह एक प्लग में मैनुअल ट्रैकिंग, या ImagePro, Volicity या AutoQuant जैसे किसी भी अन्य वाणिज्यिक आवेदन के साथ ImageJ (एनआईएच) की तरह आज़ादी से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है है.
- Excel या घर में विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पटरियों प्लॉट.
- प्रत्येक ट्रैक किए गए सेल औसत गति पथ की वक्रता, समय के साथ दिशात्मक परिवर्तनशीलता, शाखाओं में बंटी, प्रोटीन के स्रोत की ओर विचलन के रूप में गतिज मापदंडों की गणना, गणना आदि एमएस एक्सेल या किसी भी बराबर स्प्रेडशीट में किया जा सकता है . लेकिन हमारा अनुभव इंगित करता है कि यह कहीं अधिक उत्पादक घर में (आर, Matlab, अजगर, पर्ल या अन्य, ज्यादातर मुक्त स्रोत भाषाओं का प्रयोग करके) स्क्रिप्ट विकसित है, के रूप में वे अधिक लचीला अनुकूलन और उन से अधिक परिष्कृत विश्लेषणात्मक तरीकों के शामिल होने के लिए अनुमति देते हैं Excel के एक बुनियादी स्थापना में उपलब्ध है.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. संरचनात्मक origi के आरेखn explants की. यह एक hemisected फेर्रेट मस्तिष्क के राज्याभिषेक टुकड़ा की एक बैठक है. ग्रे हलकों क्षेत्र से संकेत मिलता है जिसमें से explants ले जाया गया.
चित्रा 2 एक संस्कृति सेटअप के आरेख. मनका जमा प्रोटीन के स्रोत है, explants दोनों ओर से रखा जाता है और सभी तत्वों के साथ आते हैं Matrigel.
चित्रा 3. सेल quadrants (मनका जमा ओर तीर बिंदु) द्वारा रंगीन पटरियों की इसी भूखंडों. सेल पटरियों पर सही अंश डी, जो कोशिकाओं को आकर्षित होता है की ओर पलायन कर रहे हैं, बाईं तरफ कोशिकाओं एक अंश है, जो पलायन कोशिकाओं खदेरना प्रकट होता है की ओर पलायन कर रहे हैं.
चित्रा 4. ए) चयनित एक explant से बाहर पलायन कोशिकाओं के एक से बढ़ बादल दिखा timepoints से छवियों की एक श्रृंखला. एक उदाहरण के लिए, सेल, एक तीर से संकेत, समय के माध्यम से ट्रैक के रूप में नीचे संकेत (पैमाने बार 200μm). यह explant रहते इमेजिंग के साथ 38 एच. के लिए visualized था यहाँ दिखाया गया अंतिम छवि). बी सेल हिस्से में संकेत दिया है समय पर एक संकेत के लिए छवियों रिकॉर्डिंग की शुरुआत से explant छोड़ने कोशिकाओं की छवियों. सेल दोहराव शाखाओं में बंटी (पैमाने बार 50μm) से पता चलता है है.
Discussion
यहाँ हम एक सरल प्रणाली के अध्ययन और रासायनिक संकेत के जवाब में तंत्रिका कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण मौजूद इन विट्रो प्रवास assays में कोशिकी कक्षों की हरकत को प्रभावित अणुओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हमारे प्रतिमान सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक व्यक्ति के अध्ययन कक्ष में एक 3 - आयामी (3 डी) वातावरण के साथ बातचीत करने के लिए है. यह संस्कृतियों जहां कोशिकाओं explants के बाहर पलायन पर एक काफी लाभ है पाली - डी lysine-लेपित coverslip के सपाट सतह पर ले जाने के लिए, इस प्रकार बाह्य मैट्रिक्स (जैसे Hirschberg एट अल '10 के साथ बातचीत से रहित करने के लिए मजबूर, 8. Métin एट अल. '07). हालांकि ट्रैकिंग पलायन कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर करने के लिए सम्मान के साथ, यह 2 आयामी रहता है, के रूप में कोशिकाओं खड़ी क्षैतिज स्वतंत्रता की तुलना में नीचे पर कांच coverslip और Matrigel, जो अपेक्षाकृत पतली है के ऊपर की सतह के बीच अंतरिक्ष के लिए विवश कर रहे हैं प्रवास के. इस तरह के एक सेटअप आसान आंदोलन के विश्लेषण है, जो अभी भी अनिवार्य रूप से 2 आयामी रहता है के लिए अनुमति देता है. इसी प्रकार 3 डी जीई जीई कोलेजन या Matrigel में एम्बेडेड कोशिकाओं या explants पुनः समुच्चय से मिलकर मानदंड, पहले से कार्यरत थे रासायनिक संकेत के एक स्रोत (जैसे Liodis एट अल '07 के रूप में एक विशेष संकेत प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं का समुच्चय का उपयोग कर , मार्टीनी एट अल '09, Nóbrega परेरा एट अल '08, Wichterle एट अल '03). लाटेकस मोतियों के रूप में यहाँ प्रस्तुत विधि का पालन प्रोटीन के साथ एक धीमी गति से जारी प्रणाली के लिए स्थानीय पर्यावरण में एक निरंतर स्तर है, जो अधिक से अधिक प्रोटीन मध्यम सीधे जोड़ा है के लिए अनुमति का उपयोग करता है, प्रणाली विशेष रूप से उपयुक्त बनाने के जब की राशि उपलब्ध प्रोटीन सीमित है या जब प्रोटीन का एक जटिल मिश्रण का परीक्षण किया है. मोतियों की पसंद लेटेक्स आधारित उत्पादों के लिए सीमित नहीं है, और भी अन्य सामग्री, उदाहरण के लिए agarose मोती, प्रत्येक अलग विशेषताओं के साथ शामिल हैं. आगे परख के घनत्व में वृद्धि करने के लिए, हम दो विपरीत पक्षों पर मोती जमा करने के लिए apposed explants का इस्तेमाल किया. मूल के एक विशिष्ट क्षेत्र को सुनिश्चित करने के लिए, हम कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में ganglionic श्रेष्ठता explants का इस्तेमाल किया है. हम ganglionic श्रेष्ठता का औसत दर्जे का है और पार्श्व भाग में अंतर का मूल्यांकन, लेकिन कोई अंतर नहीं देख. हम बाहर बिंदु चाहिए कि इस अध्ययन में ferrets का उपयोग करता है, इस प्रजाति में औसत दर्जे का है और पार्श्व ganglionic eminences कृन्तकों में से पहले फ्यूज ('08 Poluch एट अल.). समय संस्कृतियों बनाया गया (P0) औसत दर्जे का है और पार्श्व ganglionic eminences जुड़े हुए थे, भले ही कई neocortex populating कोशिकाओं अभी भी उत्पन्न कर रहे हैं किया जा रहा है और पलायन है. हालांकि, यदि कक्षों की वास्तव में एक समरूप स्रोत पसंद है, एक सेल निलंबन dissected ऊतक से तैयार किया जा सकता है और सीधे Matrigel के साथ मिश्रित, या वैकल्पिक रूप से नीचे घूमती है और जिसके परिणामस्वरूप गोली 'explants' बनाने के लिए छिद्रित. एंजाइमी ऊतक पाचन का उपयोग करने के लिए तैयार सेल निलंबन हतोत्साहित है, के लिए proteolytic गतिविधि का भी अवशिष्ट निशान प्रयोग के पाठ्यक्रम पर Matrigel दव्र बनाना कर सकते हैं. इसके अलावा, एक कारण परिश्रम के लिए संस्कृति की स्थापना के समय के लिए लागू किया जा है. हालांकि Matrigel वार्मिंग की अवधि polymerize भी Matrigel के छोटे बूंदों के संपर्क में हवा के सूखने का कारण बनता है और एक खोल है कि पलायन कोशिकाओं को अभेद्य है और जो मिटाया नहीं जा सकता में परिणाम (के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता) के एक थोड़ा विस्तारित अवधि की आवश्यकता है ताजा Matrigel साथ बाद में कवर के द्वारा.
Disclosures
पशु का उपयोग करें: सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं USUHS और NIH संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और USUHS IACUC ने मंजूरी दे दी है.
Acknowledgments
यह काम DoD अनुदान (SLJ) PT074620 और NIH अनुदान R01NS245014 (SLJ) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
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