Summary
Lapse imaging momento della coltura di tessuti 3D permette di studiare il comportamento migratorio delle singole cellule gangliari provenienti da primato in reazione ad estrarre proteine frazionato dalla corteccia cerebrale.
Abstract
Migrazione delle cellule è un processo comune che porta allo sviluppo e alla maturazione del sistema nervoso centrale dei vertebrati (Hatten, '99). La corteccia cerebrale è costituito da due tipi di base neuronale: eccitatorie e inibitorie. Queste cellule sorgono in aree distinte e migrano verso la corteccia lungo percorsi diversi (Pearlman et al. '98). Interneuroni inibitori migrare tangenzialmente da fonti subcorticali, per lo più provenienti da diverse regioni delle eminenze gangliari (Gelman et al, '09;. Xu et al, '04).. Il loro movimento richiede un controllo preciso spazio-temporali imposti da stimoli ambientali, per consentire la creazione di citoarchitettura corretta e la connettività nella corteccia cerebrale (Caviness e Rakic, '78, Hatten, '90, Rakic, '90). Per studiare il comportamento migratorio di cellule generate in zone proliferativa delle eminenze gangliari (GE) in furetti neonato in vitro, abbiamo utilizzato un 3 arrangiamento tridimensionale la cultura in un Matrigel BD Matrix. La configurazione cultura consisteva di due espianti GE e una fonte di proteine estratte testati dalla corteccia cerebrale ed adsorbito su fluorescente Retrobeads lattice IX posizionato tra la espianti (Hasling et al, '03;. Riddle et al, '97).. Dopo 2-3 giorni di coltura, le cellule iniziano ad apparire sul bordo del espianto mostrando una propensione a lasciare il tessuto in direzione radiale. Dal vivo immagini, gli osservazione dei modelli migratori senza la necessità di etichettatura o la marcatura delle cellule. Se esposto a frazioni della proteina estratto ottenuto dalla corteccia furetto isochronic, le cellule di GE visualizzata comportamenti diversi secondo il giudizio di analisi quantitativa cinetica delle singole cellule in movimento.
Protocol
1. Preparazione dei reagenti
- Scongelare Matrigel congelato in ghiaccio umido, lasciando il tempo sufficiente prima che l'esperimento (non accelerare il processo di riscaldamento attivo). Matrigel viene utilizzata per stabilire un ambiente 3D molto simili a una matrice extracellulare favorisce la migrazione delle cellule. Esso fornisce le cellule sia con un substrato e meccanica stringe. Matrigel è conservato congelato a -20 ° C. Prima dell'uso, va gradualmente portato fino alla temperatura di 0-4 ° C, scongelato in ghiaccio umido o in frigorifero. Matrigel fissa irreversibilmente a formare un gel della temperatura di incubazione (37 ° C). Pertanto non è raccomandato per accelerare lo scongelamento immergendo il recipiente in acqua calda.
- Frazioni proteiche sono preparati concentrandosi isoelettrico (IEF) di un estratto proteico totale da parte della corteccia cerebrale del giorno 0 postnatale (P0) furetto. Dopo la separazione, le frazioni sono dializzati durante la notte contro il 20 mM Tris-HCl pH7.2 per pulire gli estratti dai costituenti buffer di messa a fuoco, che potrebbe essere tossico per il tessuto.
- Sistema di erogazione delle proteine. Proteine estratte dalla corteccia cerebrale sono adsorbite su sfere di lattice fluorescente che poi rilasciare lentamente le proteine al environment.We scoperto che la caratteristica fluorescenza aiuta nella gestione visiva delle microsfere e consente la facile individuazione anche di spillover minimi dal sito di tallone deposito, se osservata al microscopio a fluorescenza.
- Aggiungere 10μl di perline fluorescenti a 100-200μl di soluzione proteica
- Incubare per 30 min al buio a temperatura ambiente su un agitatore
- Spin le perle giù in una centrifuga da banco per 1 ora alla massima velocità
- Rimuovere il surnatante
- Risospendere in un vortice con 10μl di terreno fresco
- Aggiungere 30μl di Matrigel alla sospensione, mescolare bene, e posto sul ghiaccio.
- Tamponi e dei media
- Preparare e sterilizzare filtrazione artificiale liquido cerebrospinale (aCSF; 124mm NaCl, NaHCO 3 26mm, NaH 2 PO 4 1,2, KCl 3,2 mm, 1,2 mm MgSO 4, CaCl 2 2,4 mm, glucosio 10mM). Slush-congelare il aCSF in anticipo, quindi è pronto al momento della dissezione dei tessuti. Per farlo, posto un recipiente di plastica pieno di aCSF sterile in un congelatore C ° -80. Monitor congelamento ogni tanto, così quando uno strato di ghiaccio si accumula sulla parte interna del muro, rompere e miscelare con il fluido. Ripetere fino a quando il pallone contiene principalmente un fango ghiacciato. Buffer preparato in questo modo non solo supporta la sopravvivenza del tessuto, ma anche tenere la temperatura più bassa, ed è meccanicamente meno dannosi per il tessuto di cubetti di ghiaccio grosso.
- Preparare medio Neurobasal con N-2 e B-27 supplementi aggiunti secondo le indicazioni del produttore, così come 1mg/100ml gentamicina, 2 mM L-glutammina, e 0,6% di glucosio. Sterilizzare per filtrazione attraverso una membrana 0.22μm. Tenere in caldo a 37 ° C fino al momento dell'uso.
- Piastre di coltura
- Cultura di qualità in plastica a sei pozzetti sono preparati da punteggiano ogni bene nel suo centro con una piccola quantità (circa 2μl) di Matrigel a freddo con 20μl punta della pipetta, e mettendo un autoclave coprioggetto di vetro rotondo 18 millimetri su ogni goccia. Né i piatti né i coprioggetti devono essere altrimenti coltura trattata.
2. Preparazione dei tessuti
- Ottenere il tessuto cerebrale
- Dopo l'anestesia profondamente l'animale con Euthasol, rimuovere il cervello e metterlo nella gelida aCSF
- Separare gli emisferi con un bisturi e tagliare coronale a 500μm utilizzando un dispositivo di scelta, raccogliendo le fette in un piatto contenente piccole ghiacciata aCSF
- Espianti fare (uso microscopio da dissezione)
- Identificare fette contenente le eminenze gangliari (GE) e regioni assetto della corteccia che possono arricciare più di GE e interferire con ulteriori passi
- Premere un Harris Uni-Core foro nella zona vicino alla superficie ventricolare di GE, ritraggono un nucleo contenente essenzialmente una zona ventricolare, ed espellere con un pistone nel ghiacciato medio (Fig.1). Da tre a quattro espianti di 0,5 mm di diametro può essere fatto da GE in un'unica fetta P0 furetto cervello. Si prega di notare che in entrambi i roditori e furetti, il GE mediale e laterale sono fusi a questa età. Se un nucleo rimane nella fetta o è attaccata al fondo del piatto di plastica, si mobilitano per spruzzando aCSF con un puntale e trasferire con una pipetta nel piatto contenente freddo medio Neurobasal. Tenere il piatto su ghiaccio bagnato.
- Trasferimento di un lotto di espianti dal mezzo in una grossa goccia di ghiacciata Matrigel (circa 0,5 ml 0,25), posto in un recipiente a parte, avendo cura di avere il espianti completamente immerso ed evitando bolle. Tenere il piatto su ghiaccio bagnato. La dimensione di una partita dipende dalla velocità del flusso di lavoro a valle.
3. Cultura impostazione (utilizzare microscopio da dissezione)
- Tenere sempre Matrigel e Matrigel contenenti mix sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione.
- Remix la sospensione tallone e il luogo 1-2μl o meno della sospensione tallone in gelide Matrigel al centro di un coprioggetto di vetro precedentemente posto in una piastra di coltura e con una punta 20μl pipetta. Gli permetta di mettere un po ', evitare l'essiccamento.
- Utilizzando una punta 20μl pipetta raccogliere due espianti dal menu Matrigel e metterli in prossimità del deposito desiderato tallone (almeno 1 mm dal bordo del deposito) simmetricamente sui lati opposti. Gli permetta di mettere per non più di 5 minuti a temperatura ambiente. Il momento giusto di passi B e C è fondamentale. Se il tempo è troppo breve porterà a gelificazione incompleta e componenti della configurazione cultura si sposta quando sono coperte con lo strato finale di Matrigel, se il tempo è troppo lungo può provocare oltre ad asciugatura del gel e la creazione di barriere fisiche che impediscono la libera circolazione delle cellule.
- Coprire le perline e l'espianto con uno strato piatto di circa 30μl di Matrigel, estendendolo al di là del espianti (Fig.2). Gli permetta di mettere in incubatrice per circa 15 minuti.
- Aggiungere 2 ml di medium Neurobasal con integratori.
- Incubare a 37 ° C in 5% di CO 2 / 95% O 2 migratori quotidiana attività di monitoraggio.
4. Vivere l'imaging
- Dopo incubazione per 3-4 giorni, rivedere le piastre di coltura e scegli coprioggetto di interesse. Il espianti dovrebbe generare una nuvola radiale uniforme delle celle. Sostituire coprioggetto scelto in una piastra di coltura fresco che saranno utilizzati nella diagnostica per immagini dal vivo.
- Lasciate che i coprioggetti siedono nella piastra di nuovo durante la notte. Prima di mettere la piastra sul microscopio per l'imaging, in una cappa di coltura cellulare, utilizzare una spatola sterile per spostare il vetrino in modo da rilasciare qualsiasi microbolle che raccolgono tra il coprioggetti e la piastra di coltura cellulare. Interferenze di bolle rovinerà le immagini. Spostare i coprioggetti al centro del pozzo.
- Per evitare l'evaporazione, riempire lo spazio tra i pozzi con acqua.
- Cura il trasferimento della targa dal cofano colture cellulari al microscopio per non spostare il coprioggetti dal centro del pozzo.
- Definire un sistema di immagine che utilizzano software di imaging. A causa della natura 3D del setup coltivare le cellule anche spostare in senso verticale, quindi è importante raccogliere Z-piani che comprende profondità della nuvola di migrazione. L'estensione XY della zona ripreso dovrebbe essere impostata anche abbastanza grande da coprire aree previsto per essere popolato da cellule migrano nel corso della registrazione, e per contenere il deposito tallone per registrare un orientamento angolare del espianto e la migrazione delle cellule rispetto al la fonte della proteina. Anche considerare che gli aerei più ripreso Z, o la zona più coperta, più tempo ci vuole per registrare un ciclo in un punto particolare momento, costringendo gli intervalli di tempo più lungo tra i campioni e una perdita di risoluzione temporale del monitoraggio delle cellule. Nel nostro caso, utilizzando un obiettivo 10x, lo schema ottimale è stata una registrazione piastrelle 3x3 per ciascuno dei 10 Z-piani distanziati ogni 20μm, a intervalli di 30 minuti. Abbiamo trovato intervalli di 30 minuti il più lungo che permette l'identificazione univoca di cellule in momenti successivi, che è critica per il monitoraggio affidabile dei loro movimenti.
- Avviare lasso di tempo di imaging.
- Dopo il tempo desiderato, rimuovere la piastra e fissare le culture nel 4% paraformaldeide tamponata con fosfato. Può essere utilizzato per ulteriori analisi morfologica ed immunocitochimica.
5. Analisi del movimento
- Convertire le serie storiche di immagini registrate in un formato più conveniente per ulteriori elaborazioni, TIFF è il più portatile.
- Traccia il movimento delle singole cellule nel corso del tempo attraverso la registrazione delle coordinate XY. Questo può essere fatto utilizzando il software liberamente disponibile come ImageJ (NIH), con un inseguimento manuale plug-in, o qualsiasi altra applicazione commerciali come ImagePro, Volicity or AutoQuant.
- Tracciare i percorsi con Excel o in-house software sviluppato.
- Per ogni cella tracciato calcolare i parametri cinetici come velocità media, curvatura del percorso, la variabilità direzionale nel corso del tempo, ramificazione, la deviazione verso la fonte di proteine, calcoli ecc può essere fatto in MS Excel o qualsiasi foglio di calcolo equivalente. La nostra esperienza indica tuttavia che è molto più produttivo per lo sviluppo in-house script (utilizzando R, Matlab, Python, Perl o altri, Lingue di partenza perlopiù aperta), in quanto permetterebbe una maggiore personalizzazione flessibile e l'inclusione dei metodi analitici più sofisticati rispetto a quelli disponibile in una installazione di base di Excel.
6. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Schema del anatomiche orin di espianti. Si tratta di un disegno di una fetta coronale di un cervello furetto hemisected. I cerchi grigi indicano la regione da cui sono state prese le espianti.
Figura 2. Schema di un setup cultura. Il deposito tallone è la fonte di proteine, il espianti sono posti su entrambi i lati e tutti gli elementi sono coperti con Matrigel.
Figura 3. Trame corrispondente di tracce cella colorata da quadranti (frecce puntano verso il deposito tallone). Le tracce celle a destra stanno migrando verso frazione D, che sembra attrarre le cellule, le cellule a sinistra stanno migrando verso una frazione, che sembra respingere migrazione delle cellule.
Figura 4. A) Una serie di immagini selezionate da timepoints mostrando una nuvola crescente di migrazione delle cellule fuori da un espianto. Una cella, ad esempio, indicato da una freccia, viene monitorato attraverso il tempo come di seguito indicato (scala bar 200μm). Questo espianto è stato visualizzato con immagini dal vivo per 38 h. Qui sono immagini di cellule di lasciare il espianto dall'inizio della registrazione delle immagini per l'immagine finale. B) La cella indicato nella parte A, secondo gli orari indicati. La cella mostra ripetitivo ramificazione (scala bar 50 micron).
Discussion
Qui vi presentiamo un sistema semplice per studiare e analizzare il comportamento migratorio di cellule neurali in risposta a segnali chimici. Nel test di migrazione in vitro sono stati utilizzati per identificare molecole extracellulari interessano la locomozione delle cellule. Il nostro paradigma garantisce che ogni singola cella in esame ha un 3-dimensionale (3D) ambiente con cui interagire. Si tratta di un notevole vantaggio rispetto culture in cui le cellule migrano da espianti sono costretti a spostarsi sulla superficie piatta di poli-D-lisina rivestite coprioggetti, quindi privi di interazioni con la matrice extracellulare (ad esempio Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). Tuttavia rispetto alla scala più ampia di monitoraggio migrazione delle cellule, rimane 2-dimensionale, in quanto le cellule sono costretti a verticalmente lo spazio tra i coprioggetti vetro sul fondo e la superficie superiore di Matrigel, che è relativamente sottile rispetto alla libertà orizzontale della migrazione. Tale impostazione consente una più facile analisi del movimento, che resta ancora essenzialmente 2-dimensionale. Simili paradigmi 3D composto da espianti GE o ri-aggregati di cellule GE incorporati in collagene o Matrigel, precedentemente impiegati, utilizzando aggregati di cellule che esprimono una particolare proteina di segnalazione come fonte di segnali chimici (ad es Liodis et al '07;. Martini et .. al '09;. Nóbrega-Pereira et al '08; Wichterle et al '03).. Il metodo qui presentato utilizza un sistema lento rilascio in forma di sfere di lattice con le proteine aderito a consentire un livello sostenuto nell'ambiente locale, che è superiore rispetto alle proteine aggiunto direttamente al terreno, rendendo il sistema particolarmente adatto quando la quantità di spazio disponibile proteine è limitato o quando una complessa miscela di proteine viene testato. La scelta di perline non è limitato ai prodotti a base di lattice, e comprende anche altri materiali, per esempio perline agarosio, ognuno con caratteristiche diverse. Per aumentare ulteriormente la densità del test, abbiamo utilizzato due espianti apposto al deposito perline su lati opposti. Per garantire una determinata area di provenienza, abbiamo utilizzato espianti eminenza gangliari come fonte di cellule. Abbiamo valutato le differenze in porzioni mediale e laterale del eminenza gangliari, ma non vede alcuna differenza. Dobbiamo sottolineare che questo studio utilizza i furetti, in questa specie le eminenze mediale e laterale gangliari miccia prima che in roditori (Poluch et al '08).. Al momento sono state effettuate le culture (P0) eminenze mediale e laterale gangliari sono stati fusi, anche se molte cellule che popolano la neocorteccia sono ancora in fase generati e la migrazione. Tuttavia, se una fonte veramente omogenea di cellule si preferisce, una sospensione di cellule può essere preparato dal tessuto sezionato e direttamente miscelato con il Matrigel, o, in alternativa centrifugare e un conseguente pellet pugni per rendere 'espianti'. L'uso di digestione enzimatica dei tessuti per preparare la sospensione cellulare è sconsigliato, perché anche tracce residue di attività proteolitica può liquefare Matrigel nel corso di esperimento. Inoltre, una due diligence deve essere applicato ai tempi del setup cultura. Anche se Matrigel richiede un periodo di riscaldamento a polimerizzare, anche un periodo un po 'prolungato di esposizione di piccole gocce di Matrigel (Ai fini del presente protocollo) per l'aria provoca l'essiccazione e risultati in un guscio che è impenetrabile per le cellule migrano e che non può essere cancellato coprendo successivo con Matrigel fresca.
Disclosures
Animale uso: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti in conformità alle linee guida NIH USUHS e istituzionali e approvato dal IACUC USUHS.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa di Grant PT074620 (SLJ) e NIH di Grant R01NS245014 (SLJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
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