Summary
3D組織培養のタイムラプスイメージングは、大脳皮質から分画されたタンパク質抽出物に反応して、神経節隆起に由来する個々の細胞の遊走挙動を調べることができます。
Abstract
細胞の遊走は、脊椎動物の中枢神経系の発達と成熟（ハッテン、'99）につながる一般的なプロセスです。興奮性と抑制：大脳皮質は、2つの基本的なニューロンタイプで構成されます。これらの細胞は、異なる領域で発生し、別の経路に沿って皮質（パールマンら 、'98）に移行する。抑制性介在は主に神経節隆起（。。Xu ら 、'04。ゲルマンら 、'09）のさまざまな地域から、接線方向に皮質下のソースからの移行。 （;ハッテン、'90、ラキッチ、'90キャヴィネス＆ラキッチ、'78）彼らの運動は、大脳皮質における適切な細胞構築との接続の確立を可能にするために、環境手がかりによって課された精密時空間制御を必要とします。 in vitroにおける新生児フェレットの神経節隆起（GE）の増殖のゾーンで生成された細胞の遊走挙動を調べるために、我々は、BDマトリゲルマトリックスの3次元培養の配列を使用する。文化のセットアップは、2つのGEの外植片とテストされた蛋白質の源大脳皮質から抽出し、外植片（。。;リドルら 、'97 Hasling ら 、'03）との間に位置する蛍光ラテックスRetrobeads IXに吸着したから成っていた。文化の2〜3日後、細胞は半径方向に組織を残す傾向を示す片の端に現れ始めます。ライブイメージングは、細胞をラベルやマーキングの必要性なしに移住パターンの観察を可能にした。等時間隔的なフェレットの大脳皮質から得られた抽出タンパク質の分画にさらされた場合、GEの細胞は、個々の移動細胞の定量的動態解析によって判断すると異なる動作を表示します。
Protocol
1。試薬の準備
- （アクティブな温暖化によってプロセスをスピードアップしていない）実験前に十分な時間を残して、濡れた氷の上で凍結したマトリゲルを解凍。 マトリゲルは、密接に細胞の移動に資する細胞外マトリックスに似た3D環境を確立するために使用される。それは、基板と包む機械の両方で細胞を提供する。マトリゲルは、-20℃で凍結保存されています使用する前に、それは徐々に0〜4の温度に育ったされるべき° C、すなわち、濡れた氷の上または冷蔵庫で解凍した。マトリゲルは、不可逆的インキュベーションの温度（37℃）でゲルを形成するために設定します。したがって、それは暖かい水で容器を浸漬することによって解凍をスピードアップすることは推奨されません。
- タンパク質画分は、生後0日（P0）フェレットの大脳皮質からの総タンパク質抽出物の等電点電気泳動（IEF）によって調製される。分離後、分画は、組織への毒性がある可能性が着目バッファの成分から抽出物をきれいにする20mMのトリス- HCl pH7.2に対して一晩透析している。
- タンパク質デリバリーシステム。 大脳皮質から抽出したタンパク質は、その後徐々に蛍光機能が微小球の視覚的な処理に役立つとのサイトからでも最低限の波及効果を容易に検出できることがわかったenvironment.Weするタンパク質を放出蛍光ラテックスビーズに吸着されています蛍光顕微鏡下で観察ビーズ預金、。
- タンパク質溶液の100 -200μlのために蛍光ビーズ10μlを追加する
- シェーカー上で室温で暗所で30分間インキュベート
- 最高速度で1時間のためのベンチの遠心でビーズをスピンダウン
- 上清を除去
- 新鮮な培地の10μlを用いて渦の再停止
- 懸濁液にマトリゲルの30μlのを追加して、よく混ぜ、そして氷上に置きます。
- バッファとメディア
- 準備とろ過滅菌人工脳脊髄液（ACSF、水素化ナトリウム、塩化ナトリウム124mM、NaHCO 3を 26ミリメートル2 PO 4さ1.2mm、3.2mmのKClを、MgSO 4をさ1.2mm、CaCl 2で 2.4㎜、グルコース10mMの）。事前にACSFをスラッシュ-フリーズので、組織の解剖の時に準備ができた。 それを行うには、-80℃の冷凍庫で滅菌ACSFで満たされたプラスチック製のフラスコを置く。時々フリーズする監視ので、氷の層が壁の内側に蓄積するとき、それを分割し、流体と混合する。フラスコは、主に氷のスラッシュが含まれるまで繰り返します。バッファは、組織の生存をサポートするだけでなく、より長い低温を保持する、と分厚い氷のキューブよりも組織に機械的に少ない有害であるだけでなく、この方法を準備した。
- N - 2でNeurobasal培地を準備し、B - 27サプリメントは、製造業者の提案だけでなく、1mg/100mlゲンタマイシン、2mM L -グルタミン、および0.6％グルコースに応じて追加。 0.22μm膜を通して濾過によって滅菌する。 37℃保温° Cを使用するまで。
- 培養プレート
- 文化グレードプラスチック6ウェルプレートは、20μlのピペットチップを用いて冷マトリゲルの少量（2μlの約）と、その中心に各ウェルに点在し、それぞれのドロップでオートクレーブラウンド18ミリメートルのガラスカバースリップを配置することによって調製される。プレートもカバースリップのどちらも扱うそうでなければ文化になる必要があります。
2。組織の準備
- 脳組織を取得
- 深くEuthasolで動物を麻酔した後、脳を除去し、氷冷ACSFに入れてください
- メスで半球を分離し、氷冷ACSFを含む小さな皿にスライスを収集し、選択したデバイスを用いて500μmでcoronallyスライス
- （解剖顕微鏡を使用）外植片を作る
- 神経節隆起（GE）とGEを介してカールして更なるステップを妨げる可能性のある皮質のトリム領域を含むスライスを特定します。
- GEの心室表面に近い領域に穴ハリスユニコアを押すと、主に脳室帯を含むコアを収納し、氷冷培地（図1）にプランジャーと一緒に排出します。0.5の3〜4片にはmmの直径は、単一のP0フェレットの脳のスライスにGEから行うことができます。げっ歯類、フェレットの両方で、内側と外側GEのがこの年齢で融合されることに注意してください。コアのスライスにとどまるまたは皿のプラスチック製の底部に付着されている場合は、コールドNeurobasal培地を含むシャーレにピペットとピペットチップとの転送でACSFを潮吹きでそれを動員する。濡れた氷の上に皿をおいてください。
- 外植片が完全に浸漬し、気泡を避けているように注意しながら、別の皿に入れ、氷冷マトリゲルの大きな落ち込み（0.25〜0.5ミリリットル程度）に培地から外植片のバッチを転送する。濡れた氷の上に皿をおいてください。バッチのサイズは、ワークフロー下流の速度に依存します。
3。文化のセットアップ（解剖顕微鏡を使って）
- 常に硬化を避けるために、マトリゲルと氷の上にマトリゲルを含むミックスをしてください。
- リミックスビーズ懸濁液を所定の位置以前にも20μlのピペットチップを用いて培養プレートに置かれたガラスのカバースリップの中央に氷冷マトリゲルのビーズ懸濁液の1 - 2μlの以下。それは少しを設定できるように、乾燥を避ける。
- 20μlのピペットチップを使用すると、マトリゲルドロップから2片を拾うと反対側に対称的にビーズ堆積物の所望の近傍（離れて預金の端から少なくとも1mm）の中に置いてください。それは、室温で5分より長くしないために設定させて。 手順bとcの右のタイミングが重要である。時間が短すぎるとそれは彼らがマトリゲルの最後の層で覆われているときに移動される文化のセットアップの不完全なゲル化し、コンポーネントにつながるだろう。時間が長すぎる場合には、ゲルと創造の過剰乾燥になることがあります細胞の自由な移動を妨げる物理的障壁 。
- 植片（図2）を越えてそれを拡張し、ビーズとマトリゲルの30μlの約の平らな層を有する外植片をカバーしています。それは約15分間インキュベーターに設定してみましょう。
- サプリメントでNeurobasal培地の2ミリリットルを追加。
- 毎日37℃、5％CO 2 / 95％O 2監視遊走活性でインキュベートする。
4。ライブイメージング
- 3-4日間のインキュベーション後、培養プレートを見直し、興味のカバースリップを選択してください。外植片は、細胞の放射状に均一な雲を生成する必要があります。ライブイメージングで使用される新鮮な培養プレートに選ばれたカバースリップを交換してください。
- カバーガラスは一晩新しいプレートに座ってみましょう。細胞培養フードの中で、イメージングのための顕微鏡でプレートを配置する前に、カバースリップと細胞培養プレートの間に収集したマイクロバブルを放出させるためにカバースリップを移動するために滅菌スパチュラを使用してください。気泡の干渉は、イメージを台無しにする。ウェルの中央にカバースリップを移動します。
- 蒸発を防ぐために、水と井戸の間にスペースを埋める。
- ウェルの中央からカバースリップを移動しないよう慎重に顕微鏡に細胞培養フードからプレートを転送する。
- イメージングソフトウェアを使用してイメージングスキームを定義する。 文化のセットアップの三次元性のために細胞はまた、垂直方向に移動し、したがって、移行の雲の完全な深さをencompassing Z - planesを収集することが重要です。画像化された領域のXYの範囲も相対的植の角度方向と遊走細胞を記録するために、録音の過程で移行する細胞によって移入されると予測領域をカバーするために、順番にビーズ預金を含むのに十分な大きさに設定する必要があります蛋白質の源。また、よりイメージ化されたZ面、またはそれ以上の面積が、それはサンプルと細胞追跡の時間分解能の損失の間に長い時間間隔を強制的に、特定の時点でサイクルを記録するためにかかる多くの時間をカバーすることを検討してください。私たちのケースでは、10倍の対物レンズを用いて、最適なスキームは、30分の間隔で、10の各Z -平面毎に20μmの間隔で配置するための3x3のタイルの録音だった。我々は彼らの動きの信頼性の追跡のために重要な、連続するタイムポイントで細胞の明確な同定を可能にするその最長30分の間隔を発見した。
- タイムラプスイメージングを開始する。
- 希望時間後、プレートを取り外し、4％リン酸緩衝パラホルムアルデヒド中で培養を修正。さらに、形態学的および免疫細胞化学的解析に使用することができます。
5。運動の解析
- TIFFは、ほとんどのポータブル一つである、さらなる処理のための最も便利な形式に画像の記録時系列に変換します。
- XY座標を記録することによって、時間をかけて個々の細胞の動きを追跡する。 これは、マニュアルトラッキングプラグイン、またはそのようなImagePro、VolicityまたはAutoQuantなどの他の商用アプリケーションでImageJのように自由に利用できるソフトウェア（NIH）を使用して行うことができます。
- Excelや社内で開発したソフトウェアを使用してトラックをプロット。
- 各追跡対象のセルは、平均速度、パスの曲率、時間をかけて方向性のばらつき、分岐、蛋白質の源に向かって偏差として運動パラメータを計算するため、などの計算は、MS Excel、またはそれと同等のスプレッドシートで行うことができます。彼らはそれらよりも高度な分析手法の、より柔軟なカスタマイズと含めることができるように我々の経験は、それが社内のスクリプトを（R、MATLAB、PythonやPerlやその他、ほとんどのオープンソース言語を使用して）開発するためにはるかに生産的であることしかし示しますExcelの基本的なインストールで利用できる。
6。代表的な結果：
図1。解剖学的origiのダイアグラムn個の外植片の。これはhemisectedフェレットの脳の冠状切片の描画です。灰色の円は、外植片が取られる領域を示している。
図2。文化のセットアップの図。ビーズ堆積物は、タンパク質の供給源であり、外植片は、いずれかの側に配置されており、すべての要素をマトリゲルで覆われている。
図3。象限によって着色されたセルのトラックの対応するプロット（ビーズ預金に向かって矢印のポイント）。右上のセルのトラックは、細胞を引き付けるために表示される割合Dに向かって移行して、左側の細胞が遊走する細胞を撃退するために表示される小数部に向かって移行しています。
図4。外植片から遊走細胞の成長クラウドを表示する選択した時点においての画像のA）シリーズ。 （スケールバー200μmの）下に示すように矢印で示されている例のセルが、、時間によって追跡されます。この外植片は38時間にわたってライブイメージングで可視化した最終的な画像に画像を記録するの最初から外植片を残して細胞のイメージがあるここに示されている。B）常に部分に示されているセルが示された。セルは、反復的な分岐を（スケールバーは50μmの）を示しています。
Discussion
ここでは、化学物質の合図に応答する神経細胞の遊走挙動を研究し、分析するためにシンプルなシステムを提示する。vitroでの遊走アッセイでは細胞の運動に影響を及ぼす細胞外分子を識別するために使用されています。私たちのパラダイムは、検討した各々のセルが相互作用する3次元（3D）の環境を持つことが保証されます。 それは、細胞外マトリックス（例えばヒルシュら '10との相互作用のため、欠けている、ポリ- D -リジンコートしたカバースリップの平らな面に移動を余儀なくされている細胞は、外植片からの移行の文化上のかなりの利点である、8。メティンら '07）。細胞が縦方向に水平方向の自由と比較して下部のガラスのカバースリップと比較的薄いマトリゲル、の上面との間のスペースに制約されているとして、しかし追跡移行する細胞の大規模に関しては、それは、2次元のまま移行の。そのような設定はまだ本質的に2次元のままの動きを簡単に解析、することができます。 。マティーニら 、コラーゲンやマトリゲル中に埋め込 まれたGEの細胞のGEの外植片または再集計で構成される同様の3Dパラダイムは、以前に化学物質の手がかりのソース（例えばLiodis ら '07として特定のシグナル伝達タンパク質を発現する細胞の集合体を使用して、採用されたら'09、。。。ノブレガ-ペレイラら '08、Wichterle ら'03）。。タンパク質が時利用可能な量のシステムが特に適して、培地に直接添加よりも高い場合、ローカル環境の持続的なレベルを可能にするために付着したタンパク質を持つラテックスビーズの形で徐放システムを採用してここで紹介する方法、タンパク質は限られているかタンパク質の複雑な混合物がテストされている場合。ビーズの選択は、ラテックスベースの製品に限定し、また他の材料、例えば、アガロースビーズ、それぞれ異なる特性を持つが含まれていません。さらにアッセイの密度を高めるために、我々は反対側にビーズの堆積物に並列したtwo植片を使用。起源の特定の領域を確保するために、我々は細胞のソースとして神経節隆起の外植片を使用している。我々は、神経節隆起の内側と外側部分の違いを評価したが、違いを見ていない。我々は、本研究では、フェレットを使用していることを指摘しておきますが、この種では内側と外側神経節隆起は、げっ歯類（。Poluchら '08）よりも前のヒューズ。文化が作られた時間（P0）で内側と外側神経節隆起は新皮質の移入多くの細胞がまだ生成され、移行されているにもかかわらず、融合させた。細胞の真に均質なソースが好まれている場合は、、細胞懸濁液は、解剖組織から調製することができ、直接マトリゲルと混合、あるいはスピンダウンし、得られたペレットは、"植"を作るためにパンチ。タンパク質分解活性のさえ残存痕跡が実験の過程でマトリゲル液化できるため、細胞懸濁液を調製するための酵素組織消化の使用は、推奨されていません。また、デューデリジェンスは、文化のセットアップのタイミングに適用する必要があります。マトリゲルは、温暖化の期間は、乾燥空気の原因と遊走細胞を通さないで、消去することができるシェルの結果にマトリゲルの小滴の露出（としてこのプロトコルで使用されている）の少しでも長期間を重合するために必要ですが、新鮮なマトリゲルとその後の被覆による。
Disclosures
動物の使用：動物に関わるすべての手続きがUSUHSとNIH機関のガイドラインにしたがって実行し、USUHS IACUCによって承認された。
Acknowledgments
この作品は、DoDのグラントPT074620（シャングリラホテル）とNIHグラントR01NS245014（シャングリラホテル）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
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